1、青島農業大學學報(自然科學版) 26(2):131 135, 2009JornalofQingdaoAgricltralUniversity(NatralScience)文章編號:1674 148X(2009)02 0131 05昆蟲細胞 BTI-Tn-5B1 -4和 Sf-9的無血清培養及其特性研究, 馬明,勛(青島農業大學無脊椎動物細胞培養和細胞工程中心, 山東 青島 266 09)摘要:本研究對目前應用最多的兩種昆蟲細胞 BTI Tn 5B1 4和 Sf 9在無血清培養基 Sf 900 中進行馴化和培養, 現已傳至 45代以上。 比較了兩種細胞在 Sf 900 和有血清培養基 TNM F

2、H中的細胞形態、生長速率、產量和重組蛋白表達水平。 結果表明, 在 Sf 900 中 Sf 9細胞比 TNM FH培養的略大, BTI Tn 5B14的圓形細胞增多, BTI Tn 5B1 4和 Sf 9在 Sf 900 中生長速度快, 群體倍增時間分別為 18.5h和 21.7h,而在 TNM FH中, BTI Tn5B1 4和 Sf 9的群體倍增時間分別為 21.9h和 25.4h;在兩種培養基中 BTI Tn5B1 4和 Sf 9細胞的率、多角體產量和 半乳糖苷酶(galactosidase)的表達水平均無明顯差異, 而堿性磷酸酶(secretedalkalinephosphatase,

3、 SEAP)在 Sf 900 中的表達水平明顯高于 TNM FH中的水平 。:昆蟲細胞;無血清培養;生長曲線;號:Q813.1 1產量;蛋白表達文獻標識碼:AStudyonCharacteristicsofBTI-Tn-5B1 -4 andSf-9 CelsAdaptedinSerum -MediumLIYinhua, ZHENGGuiling, LIChangyou, MALIGuoxun(ACenterforAdvancedInvertebrateCelCultureandCelEnginering, QAU, Qingdao266 09,Abstract:BTI Tn 5B14 andS

4、f 9 cellines, thataredominantce lineswithbasicstudyandaplicationintheworld, wptedtoaserummedium, Sf 900 foraproximately45 pasages.Thecharacteristicsproductionandrecombinantproteinexpresionwerecomparedwith FH.TheresultsshowedthatthetwocelslineinSf 900 werelitleincludingmorphology, growthkinetics,that

5、oftheygrewinSf 900 andTNMbigerthaninTNM FH.ThecelpopulationdoublingtimesofbothBTI Tn5B14 andSf 9 celsinSf 900(18.5 and21.7 h, respectively)shortenedincomprisiontothatinTNM FH(21.9 hforBTI Tn5B14 and25.4 hforSf 9).Theinfectionrate, productionofpolyhedraandexpresionofgalactosidase(gal)inbothtypesofmed

6、iawerenotsignificantlydiferent, butheexpresionofsecretedalkalinephosphatase(SEAP)inSf 900 mediumwashigherthaninserum containingcultures.Keywords:ce lines;serumculture;growthkinetics;production;proteinexpresion自 1962年 Grace蟲細胞系以來, 已經從當有吸引力的新途徑, 因此, 昆蟲細胞培養已在生物學、農業以及醫學等領域得到廣泛應用 。目前建立了世界上第一個昆100多種昆蟲建立了

7、5001多株細胞系, 昆蟲細胞可以作為載體生產生物,是在含有昂貴胎牛血清 (fetalbovum, FBS)的昆蟲細胞表達系統的建立, 為培養基中培養昆蟲細胞, 高成本限制了大規模培養另外由于桿狀技術的發展, 而且血清的生產許多具有重要生物學價值的重組蛋白提供了相還會給基因工程表達收稿日期:200828基金項目: 作者簡介:通訊作者:自然科學基金(3077 45 )973計劃(2009CB8902)( 983 ), 女, 山東泰安人, 在讀, 研究方向:昆蟲細胞培養。勛,gxli青島農業大學學報(自然科學版)26卷132產物的后處理帶來。此外, 血清還是支原體和細胞形態觀察和大小的測量 :在不

8、同培養基中培養的細胞, 28條件下培養 , 在 OlympusIX71 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態并拍照, 隨機選取100個細胞, 通過顯微標尺測量細胞的大小。細胞生長曲線的測定:取對數生長期細胞 , 用血球計數板計數后, 用相應培養基稀釋到 25210 cels/ml的濃度 , 加到 25cm 培養瓶中, 每瓶5ml, 28條件下培養。每天取 3 瓶細胞, 用血球計數板計數, 計算細胞的平均濃度, 繪出細胞生長曲污染的重要來源。無血清培養基的優其它點在于化學成分明確, 培養條件容易, 減少了不同批次培養基之間在數量和質量上的差異, 除去了微生物污染的潛在來源, 利于細胞培養產物的分離等操作

9、。因此發展昆蟲細胞無血清培養基一直是細胞培養工程領域的研究熱點 。目前世界上應用最多的 細 胞 系 主要 是 來 源 于 草 地 貪 夜蛾(Spodopterafrugiperda)的 Sf 21或其克隆株 Sf2, 39和粉紋夜蛾 (Trichoplusiani)的 BTI Tn5B1線, 并按 Hayflick等時間。侵染和 產量的測定 :取對數生長期的細胞, 血球計數板計數后, 按 1.0 105 cels/孔的量接入 24孔細胞培養板中, 3次重復;28培養 2h, 吸的計算細胞群體倍增4(HIGHFIVE), 本文對 Sf 9和 BTI Tn5B14進行無血清培養和馴化, 并研究在無

10、血清培養條件下細胞的生物學特性, 為重組蛋白和量生產提供理論依據和有效途徑。1 材料和1.1 材料殺蟲劑的大去培養基, 每孔加入 AcMNPV 1A復數MOI=10), 吸附 1h后棄去液, 每孔加入 1ml新鮮培養基, 28培養并觀察, 120h后檢查侵染細胞系 :BTI Tn5B14(HIGHFIVE)細胞系 ,結果,多角體 (OB)產量的測定參照 Wang。5 的康奈爾大學 Granados博士惠贈 ;Sf 9細胞康奈爾大學 Blisard博士惠贈。由系, 由等堿性磷酸酶 (SEAP)和 半乳糖苷酶 ( gal)的表達:取對數生長期細胞, 按 1.0105 cels/孔的量接入 24孔板

11、中, 28培養 2h, 吸去培養基,:苜蓿銀紋夜蛾核型多角體昆蟲(AutographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisAcMNPV)AcMNPV 1A株以及重組Ac康AcMNPV SEAP和 AcMNPV gal將重組MNPV SEAP和 AcMNPV 奈爾大學 Granados博士惠贈 。gal等, 均由按復數 MOI=10 的比例細胞, 吸附 1h后棄去液, 每孔加入 1ml新鮮培養基 , 28條件下67的培養基 :有血清培養基為 TNM FH昆蟲細胞培養基, 由 Grace細胞培養基 (GIBCO)改進并輔以 10%胎牛血清 (MD genic

12、s公司 ), 無血清培養基為 Sf 900 SFM昆蟲細胞培養基(GIBCO)。1.2細胞的傳代培養 :待細胞生長鋪滿 25cm2 培養瓶 (Corning公司 )瓶底 , 在超凈工作臺中用吸管輕輕吹打貼壁細胞, 制成細胞懸液, 取 1ml細胞并加入 4ml新鮮培養基于培養瓶中, 置于 28 培養箱中靜置培養, 每隔 3 4d傳代 1次。細胞的無血清培養和馴化 :將在含 10%胎牛血培養, 按 Davis等 和 Zheng等蛋白的表達。2 結果與分析2.1 細胞的無血清培養和馴化, 測定重組兩種細胞從含 10%FBS的 TNM FH培養基分別經過含 8%、5%、3%和 1%FBS的 Sf 90

13、0 SFM培養基, 最后到 Sf 900 SFM無血清培養基的適應過程中, BTI Tn5B1 4的馴化過程較慢, 細胞在含 8%和 5%FBS的培養基中 , 培養的第 1胞表現出生長緩慢, 部分細胞懸浮破碎, 需及時更換新鮮培養基, 當細胞生長鋪滿培養瓶底時進行傳代,傳代 3次后, 細胞生長狀態良好。在轉到含 3%FBS的培養基時, 細胞比在 TNM FH培養基中的略大, 生長緩慢且率高, 馴化過程較長, 培養 10細胞生長逐漸。繼續馴化到含 1%FBS的培養基, 直至 Sf 900 SFM中 , 最初培養的 1 2胞生長均較緩慢, 當適應后生長速率則明顯加快, 平清的 TNM FH培養基中

14、生長的 BTI Tn5B14和 Sf 9細胞, 按細胞的傳代培養, 分別依次傳代于含 8%、 5%、 3%、 1% FBS的 Sf 900SFM培養基中 , 在每種 FBS濃度的培養基中適應并傳 3, 再于下一個 FBS濃度的培養基中能培養, 直至在完全無血清培養基 Sf 900 SFM中適應并傳代。2期, 等:昆蟲細胞 BTI Tn 5B14和 Sf 9的無血清培養及其特性研究133均每 3d正常傳 1代, 整個馴化過程用了 42.85m Tn5B118.592.40m;而在TNM FH中 BTI的時間。與 BTI Tn5B14相比, Sf 9的適應較快, 大約經歷 45d的時間就能夠在 S

15、f 900 SFM中生長并正常傳代培養。目前 BTI Tn5B14 和 Sf 9已在無血清培養基中分別傳代 45代和 48代。2.2 細胞的形態比較BTI Tn5B14 和 Sf 9 兩種細胞在 TNMFH和 Sf 900 SFM培養基中的形態見圖 1。在 Sf 900 SFM中, BTI Tn5B14 細胞變得短而粗,而且圓形細胞增多, 大約占 37.3%, 直徑為 19.644 圓形細胞的比例約為 10.0%, 直徑為16.563.01m, 梭形細胞占大多數, 約占 90.0%,大小為 52.164.52m 15.542.30m。 Sf 9細胞在兩種培養基中均為圓形, 在 Sf 900 S

16、FM中略微變大, 細胞直徑為 16.19TNM FH中為 14.742.03m。1.37m, 而在2.3 細胞的生長曲線與群體倍增時間BTI Tn5B14和 Sf 9在 Sf 900 SFM中連續傳代 20代以后 , 細胞生長迅速 , 狀態良好 。2.65m, 梭形細胞約占62.7%, 大小為36.42細胞生長曲線見圖 2。在 Sf 900SFM中, BTI圖 1 BTI Tn5B1 4和 Sf 9細胞在兩種培養基中的形態A.TNM FH中的 BTI Tn5B 4 細胞;B.Sf 900 SFM中的 BTI Tn5B4細胞;C.TNM FH中的 Sf 9細胞;D.Sf 900 SFM中的 Sf

17、 9細胞圖 2 兩種細胞在不同培養基中的生長曲線A.BTI Tn5B 4 細胞;B.Sf 9 細胞青島農業大學學報(自然科學版)26卷1346Tn5B14細胞最高密度可達 2.3410 cels/ml, Sf 9細胞最高密度可達 2.7510 cels/ml。在 Sf900 SFM中 , BTI Tn5B1 4和 Sf 9的群體倍增時間分別為 18.5h和 21.7h, 均比在 TNM FH中生長速度快, 在 TNM FH中 , BTI Tn5B1 4和 Sf 9的群體倍增時間分別為 21.9h和 25.4h。3。 BTI Tn5B14和 Sf 9細胞在兩種培養基中6對 AcMNPV均比較敏感

18、,率均在 90%以上。BTI Tn5B1 4 細胞在 Sf 900 SFM和 TNMFH中的多角體產量分別為 81.73 和 80.15 OBs/ cel, 二者差異不顯著, 但均顯著高于 Sf 9 細胞的多角體產量。 Sf 9細胞在 Sf 900 SFM和 TNM2.4FH中的多角體產量分別為cel, 差異也不顯著。31.95和29.96 OBs/的侵染和產量侵染和多角體產量測定結果見附表和圖圖 3 AcMNPV對兩種培養基中 BTI Tn5B1 4和 Sf 9細胞的侵染A.TNM FH中的 BTI Tn5B 4 細胞;B.Sf 900 SFM中的 BTI Tn5B4細胞;C.TNM FH中

19、的 Sf 9細胞;D.Sf 900 SFM中的 Sf 9細胞兩種培養基中 BTI Tn5B14和 Sf 9細胞的侵染率和產量比較4在 Sf 900 SFM和 TNMFH兩種培養基中附表的 半乳糖苷酶( gal)表達量在第 8 d達到最高, 分別為 1.86 10 IU/ml和 1.54 10 IU/ml, 差異不顯著 ;Sf 9細胞在兩種培養基中的表達量在第 8 d也達到最高, 分別為 0.88 10 IU/ml和 0.6210 IU/ml, 差異也不顯著。而 BTI Tn5B14 在 Sf900 SFM中堿性磷酸酶 (SEAP)的表達水平較TNM FH中有顯著提高 , 第 7d的表達量分別為

20、3.90 IU/ml和 2.28 IU/ml;Sf 9在 Sf 900 SFM中 SEAP的表達量也較 TNM FH中高, 第 7 d的表達量分別為 0.69 IU/ml和 0.41 IU/ml。從圖 4 還可看出, BTI Tn5B14細胞表達兩種重組蛋白的水平均較 Sf 9高, 大約是 Sf 9表達量的 2 5倍。侵染率(%)多角體產量(OBscel)細胞培養基BTI Tn5B4TNM FH Sf 900 SFMTNM FH97.594.294.692.380. 5 8 .73 29.963 .952.35 A.52 A.38 B2.24 BSf 9Sf 900 SFM注:相同字母表示差異

21、不顯著(P<0.0 )。2.5半乳糖苷酶 (gal)和堿性磷酸酶(SEAP)的表達重組蛋白的表達結果 (圖4)可見, BTI Tn5B12期, 等:昆蟲細胞 BTI Tn 5B1 4和 Sf 9的無血清培養及其特性研究135圖 4BTI Tn5B14和 Sf 9細胞在兩種培養基中重組蛋白的表達水平A. 半乳糖苷酶( gal)的表達;B.堿性磷酸酶(SEAP)的表達良好基礎。3討論參考文獻:昆蟲細胞的無血清培養在大量生產殺蟲劑 GranadosRR, LiGX, BlisardGW.Insectcelcultureandbio-technology J .VirologicaSinica,

22、 2007, 22(2):83 93.和表達重組蛋白方面具有十分廣闊的應用前景, 有研究者對昆蟲細胞的無血清培養進行了一些嘗試和 2,萌.昆蟲細胞無血清培養 J .細胞生物5, 8 10, 為大規模的商業化生產奠定了理論基研究學雜志, 2005, 27(2): 27 32.TaticekRA, ChoiC, PhanSE, etal.Comparisonofgrowthand recombinantproteinexpresionintwodiferentinsectce linesinat- tachedandsuspensionculture J .BiotechnolProg, 200

23、, 7(4):676 684.HayflickL.Theoryofpopulationincreasebysubcultivation.Tisue culturemethodsandaplication.(eds, KrusePF, PatersonM K) M .AcademicPres, NY. 973, 222 223.礎。本文通過對目前國際上應用最多的 BTI Tn 5B1 4和 Sf 9 細胞系進行無血清培養馴化和生物學特性比較, 發現 Sf 900 SFM無血清培養基可以提供以上兩種細胞快速生長所需的營養, 并實現高產量的 增殖和高水平的蛋白表達, 為昆蟲細胞在無血清條件下的大規模

24、培養提供有效的途徑。 3 4 5WangP, GranadosRR, ShulerM L.Studiesonserumcul-tureofinsectcelsforpropagationandrecombinantproteinpro-無血清培養是今后昆蟲細胞的必然趨duction J .Invertebr.Pathol., 992, 59:46 53. DavisTR, TroterKM, GranadosRR, etal.Bacul勢, 目前商業化生產的無血清培養基通常有很高的細胞特異性, Sf 900 SFM是一種適用于 Sf 9和Sf 21等細胞系的無血清培養基, 因此, Sf 9 細胞 6expres-sionofalkalinephosphataseasareportergeneforevaluationofpro-duction, glycosylationandsecretion J .BioTechnology,992,0: 4850.在其中的適應較快, 而 BTI Tn 5B14細胞的適 7ZhengGL, LiCY, LiGX, etal.Constructionandcharacteris-t