1、1細胞自噬機制細胞自噬機制主講人：晏劍虹主講人：晏劍虹克里斯汀克里斯汀德德迪夫（迪夫（Christian deDuve）比利時科學家比利時科學家Christian de DuveChristian de Duve在上世紀在上世紀5050年代通過電鏡觀察到年代通過電鏡觀察到自噬體（自噬體（autophagosomeautophagosome）結構，）結構，并且在并且在 1963 1963 年溶酶體國際會議年溶酶體國際會議（CIBA Foundation Symposium CIBA Foundation Symposium on Lysosomeson Lysosomes）上首先提出了）上首先提

2、出了“自噬自噬”這種說法。因此這種說法。因此Christian de DuveChristian de Duve被公認為自噬被公認為自噬研究的鼻祖。研究的鼻祖。Christian de Duve Christian de Duve 也因發現溶酶體，于也因發現溶酶體，于19741974年獲得年獲得諾貝爾獎諾貝爾獎大隅良典大隅良典2016年，因年，因“在細胞自噬機在細胞自噬機制方面的發現制方面的發現”而獲得諾貝爾而獲得諾貝爾生理學或醫學獎。大隅教授的生理學或醫學獎。大隅教授的貢獻在于，他找到了酵母這種貢獻在于，他找到了酵母這種簡單又與人體細胞相似的實驗簡單又與人體細胞相似的實驗模型，將復雜的問題化

3、難為易模型，將復雜的問題化難為易了。了。大隅良典大隅良典宮崎駿宮崎駿在酵母菌體內(左側)存在一個巨大的細胞器，名為液泡，其功能與人以及其他哺乳動物體內細胞內的溶酶體相類似。于是他培養了經過改造，缺乏液泡膜降解酶的酵母菌并通過饑餓的方法激活細胞的自噬機制。此時，當這些酵母菌遭受饑餓時，吞噬小體開始在液泡內部大量聚集(右圖)。大隅良典的實驗證明酵母菌內部存在自噬現象。此后，大隅良典教授對數以千計的酵母菌變異樣本進行了核對(右側)，并從中找到了據信與自噬作用密切相關的15組基因。凋亡凋亡 與自噬與自噬表中可以看出，在過去的十年之中，幾乎每個生命科學家都知道表中可以看出，在過去的十年之中，幾乎每個生命

4、科學家都知道“凋亡凋亡”這個概這個概念并且有意無意將自己的研究工作與之掛鉤。自噬（念并且有意無意將自己的研究工作與之掛鉤。自噬（autophagyautophagy）是繼凋亡）是繼凋亡（apoptosisapoptosis）后，當前生命科學最熱的研究領域，）后，當前生命科學最熱的研究領域，PubmedPubmed記錄的文獻數量在最記錄的文獻數量在最近近4 4年呈爆炸式增長，其中年呈爆炸式增長，其中20062006年以前相關文獻大約年以前相關文獻大約15001500條。條。20072007年是自噬研究年是自噬研究有歷史意義的一年，召開了第一次自噬國際會議，與會人員構成自噬學術圈的奠有歷史意義的一

5、年，召開了第一次自噬國際會議，與會人員構成自噬學術圈的奠基者，并且在各自領域宣傳和研究一些基本概念。基者，并且在各自領域宣傳和研究一些基本概念。20072007年到年到20102010年年9 9月短短三年月短短三年文獻發表量達到大約文獻發表量達到大約44004400條。我們堅信在未來十年條。我們堅信在未來十年“自噬自噬”也將會成為另一個也將會成為另一個“萬金油萬金油”和生命科學的和生命科學的“閃亮新星閃亮新星”。在大隅良典發現細胞自噬的關鍵機制之后，研究局面豁然開朗，相關論文發表量驟然上升。在大隅良典發現細胞自噬的關鍵機制之后，研究局面豁然開朗，相關論文發表量驟然上升。細胞自噬的定義細胞自噬的

6、定義l細胞自噬(autophagy)是真核生物中進化保守的對細胞內物質進行周轉的重要過程。該過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹后，送入溶酶體(動物）或液泡（酵母和植物）中進行降解并得以循環利用。細胞自噬基本過程細胞自噬基本過程自噬基本過程：自噬基本過程：1.1.自噬前體的形成自噬前體的形成2.2.自噬體的形成自噬體的形成3.3.自噬溶酶體的融合自噬溶酶體的融合4.4.自噬體的溶解自噬體的溶解內涵體自噬內涵體溶酶體自噬溶酶體自噬前體 自噬體細胞自噬分類細胞自噬分類（根據進入溶酶體途徑不同）（根據進入溶酶體途徑不同）l巨自噬巨自噬l微自噬微自噬l分子伴侶介導的自噬分子伴侶介導的

7、自噬巨自噬巨自噬內外刺激誘導下，細胞通過自噬基因調控組裝自噬前體。自噬體內外刺激誘導下，細胞通過自噬基因調控組裝自噬前體。自噬體包裹細胞質包裹細胞質,細胞器或細菌等形成自噬體，在微管作用下，自噬細胞器或細菌等形成自噬體，在微管作用下，自噬體與溶酶體靠近，自噬體外層膜與溶酶體膜融合，包有內層膜的體與溶酶體靠近，自噬體外層膜與溶酶體膜融合，包有內層膜的自噬體進入溶酶體，形成自噬溶酶體。繼而，自噬體內膜被溶酶自噬體進入溶酶體，形成自噬溶酶體。繼而，自噬體內膜被溶酶體酶降解，繼而內容物被降解，營養成分被細胞重新利用。體酶降解，繼而內容物被降解，營養成分被細胞重新利用。微自噬微自噬主要集中于酵母。當受到

8、饑餓等刺激時，溶酶體膜局部凹陷，吞噬細胞質或微體，形成自噬體。自噬體脫離溶酶體膜，進入溶酶體腔，由溶酶體酶降解，降解物質被細胞再利用。分子伴侶介導的自噬（分子伴侶介導的自噬（CMACMA）l 分子伴侶介導的自噬（分子伴侶介導的自噬（CMACMA）：胞質內蛋白結合到）：胞質內蛋白結合到分分子伴侶子伴侶后被轉運到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消后被轉運到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化。化。CMA CMA 的底物是可溶的蛋白質分子，在清除蛋白的底物是可溶的蛋白質分子，在清除蛋白質時有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性。質時有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性。l 分子伴侶：分子伴侶：一類在序列上沒有相關性但有共

9、同功能的蛋白質，它們在細胞一類在序列上沒有相關性但有共同功能的蛋白質，它們在細胞內幫助其他含多肽的結構完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，內幫助其他含多肽的結構完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構成這些蛋白質結構執行功能的組份不構成這些蛋白質結構執行功能的組份自噬的特性自噬的特性l 1）自噬是細胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎對細胞不利。事實上，細胞正常情況下很少發生自噬，除非有誘發因素的存在。這些誘發因素很多，也是研究的熱門。既有來自于細胞外的（如外界中的營養成分、缺血缺氧、生長因子的濃度等），也有細胞內的（代謝壓力、衰老或破損的細胞器、折疊錯誤或聚

10、集的蛋白質等）。由于這些因素的經常性存在，因此，細胞保持了一種很低的、基礎的自噬活性以維持自穩。l 2）自噬過程很快，被誘導后8min即可觀察到自噬體（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶體（autolysosome）基本降解消失。這有利于細胞快速適應惡劣環境。l 3）自噬的可誘導特性：表現在2個方面，第一是自噬相關蛋白的快速合成，這是準備階段。第二是自噬體的快速大量形成，這是執行階段。l 4）批量降解：這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區別l 5）“捕獲”胞漿成分的非特異性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特異性不是首先考慮的，這與自噬的應急特性是相適應的。l 6）自噬的保守性：由于自

11、噬有利于細胞的存活，因此無論是物種間、還是各細胞類型之間（包括腫瘤細胞），自噬都普遍被保留下來（誰不喜歡留一手呢？）。微管相關蛋白輕鏈微管相關蛋白輕鏈3 3（MAP-LC3MAP-LC3）12135-1-AP微管相關蛋白輕鏈微管相關蛋白輕鏈3（MAP-LC3），簡稱），簡稱LC3，參與了自噬的形成，并被證明了是哺乳動物細胞中常見的自噬小，參與了自噬的形成，并被證明了是哺乳動物細胞中常見的自噬小體標記蛋白之一體標記蛋白之一。Western blot可能會檢測到LC3的兩種形式，這是由于自噬形成時，胞漿型LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(PE)結合轉變為（自

12、噬體）膜型（即LC3-II），這兩種形式在正常細胞中都是存在的，而發生自噬的細胞中LC3-II會有明顯的增加。l 一是形成增加即自噬被誘導；l 另外一種是自噬體成熟受抑即自噬體不能和溶酶體結合。l 自噬誘導劑l 1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激l 2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）l 3）Earles平衡鹽溶液：制造饑餓l 4）N-Acetyl-D-sphingosine（

13、C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑l 5）Rapamycin：mTOR抑制劑l 6）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑自噬的抑制劑自噬的抑制劑l 根據自噬形成的過程，自噬的抑制也分為不同的階段，包括自噬的起始階段，自噬泡和溶酶體融合階段，以及溶酶體內的降解階段。目前常用的一些抑制藥物如下：l （1）對自噬體形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制劑（如3-MA），這些藥物均可干擾或阻斷自噬體形成。l （2）對自噬體與溶酶體融合的抑制：對自噬體與溶酶體融合過程進行阻斷也能起著抑制自噬的作用，這些藥物有巴伐洛霉素A1、長春堿、諾考達唑等。l （3）對

14、溶酶體降解的抑制：蛋白酶抑制劑，如E64d、Pepstatin A等自噬體的檢測自噬體的檢測l （1）以透射電子顯微鏡下超微結構的形態學檢測。l （2）自噬體膜標志性蛋白質的檢測。l （3）單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。l （4）檢測長壽蛋白的批量降解l （5）CellTrackerTM Green染色細胞自噬功能細胞自噬功能l （1）細胞自噬通過防御環境變化和應激代謝反應調控來維持細胞內部 的穩態。l （2）細胞自噬具有自我“清理”功能，可以處理細胞內的廢物，降解 錯誤折疊的 蛋白質多聚體，減少DNA的損傷和染色體的不穩定性， 防止異常蛋白質累積，還能降解功能 失常的線粒體、高爾基體等

15、 細胞器，對蛋白質和細胞器進行質量控制 ，并且通過降解底物來為細胞生存提供原材料或ATPl （3）細胞自噬甚至可以清除細胞內的病原體，保護細胞免受損傷，對于對抗癌癥、衰老、神經退行性病變、感染等都有著重要的意義。l （4）細胞自噬是程序性細胞死亡的一種，在某些情況下，若細胞無法 繼續維持自身的生存，細胞自噬會誘導細胞主動性死亡。l 與凋亡（在腫瘤細胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被優先保留的。無論是腫瘤細胞還是正常細胞，保持一種基礎、低水平的自噬活性是至關重要的。因為細胞中隨時產生的“垃圾”（破損或衰老的細胞器、長壽命蛋白質、錯誤合成或折疊錯誤的蛋白質等等）都需要及時清除，而這主要靠自噬來完成，因此，自噬具有維持細胞自穩的功能；如果將自噬相關基因突變失活，如神經元會發生大量聚集蛋白，并出現神經元退化。同時，自噬的產物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質又可為細胞提供一定的能量和合成底物，可以說，自噬就是一個“備用倉庫”。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就會餓死。更重要的是，自噬活性可在代謝應激（饑餓、生長因子缺乏、射線、化療等）時大大增強l ，表現為胞漿中迅速涌現大量自噬體，這一現象被稱為“自噬潮”（autophagic flux），廣泛用于自噬形成的監測。自噬潮為細胞度過危機提供了緊急的營養和能量支持，有利于