1、    【摘要】目的分析血液制品特定滅活因子的時效動力學曲線，科學性地評價與改進不合理的病毒滅活參數(shù)。方法系統(tǒng)性整理針對水皰性口炎病毒、黃熱病毒、脊髓灰質炎病毒、偽狂犬病毒、腦心肌炎病毒、人類免疫缺陷病毒，人血白蛋白采用巴氏消毒法，狂犬病人免疫球蛋白采用低pH常溫孵放法，靜注人免疫球蛋白、靜注人乙肝免疫球蛋白采用低pH/巴氏消毒法；人纖維蛋白原、人凝血因子采用有機溶劑/去污劑與干熱法滅活病毒的驗證資料，統(tǒng)計3批樣品多個取樣點的殘余病毒滴度均值、標準差與變異系數(shù)，制作滅活病毒動力曲線圖并進行分析。結果人血白蛋白巴氏滅活VSV與Sindbis病毒，HRIG低

2、pH滅活VSV和Sindbis病毒，HRIG低pH滅活HIV病毒，IVIG低pH/巴氏滅活HIV病毒，IVIG低pH滅活HIV病毒，HBIG低pH/巴氏滅活VSV、Sindbis與Polio病毒。結論建議改進病毒滅活驗證標準與不合理的滅活參數(shù)；采用終產品樣品通過合適細胞或方法直接培養(yǎng)目標病毒來有效監(jiān)測血液制品的病毒安全性。【關鍵詞】血液制品；病毒滅活；動力學EvaluationonviralinactivationfactorandkineticsofbloodplasmaproductsWEIXian-yi,WEIHong,JIANYuan-yong，etal.SichuanYuandaSh

3、uyangMedicineIndustryLimitedCompany,Chengdu610214,ChinaAbstractObjectiveForthepurposeofscientificevaluationandimprovementonunreasonableparameterofviralinactivation,thedynamicscurveoftimecorrespondingtoeffectbygivenviralinactivationfactortreatedtobloodplasmaproductwereanalyzed.MethodsAimedatvesicular

4、stomatitisvirus,sindbisvirus,humanimmunodeficiencyvirus,polioviruses,pseudorabiesvirus,encephalon-yocarditisvirus;validatedataofviralinactivatedonpasteurizationofalbumin,humanrabiesimmunoglobulinwithpH4,humanimmunoglobulinandhumanhepatitisBimmunoglobulinforintravenousinjectionwithpH4/pasteurization,

5、treatmentonhumanfibrinogenandhumancoagulationfactorwithsolvent/detergentandvaporheatingat10030minweresystemicregularizedrespectively.Themeanandstandarddeviationalsocoefficientofvariationforvirussurvivaltiterindifferenttimewerestated,dynamicscurveofvirusinactivationweremadeandanalyzed.ResultsHumanalb

6、uminpasteurizationinactivatedVSVandSindbisvirus,HRIGlowpHinactivatedVSVandSindbisvirus,HRIGlowpHinactivatedHIVvirus,IVIGlowpH/pasteurizationinactivatedHIVvirus,IVIGlowpHinactivatedHIVvirus,HBIGlowpH/pasteurizationinactivatedVSV,SindbisandPoliovirus.ConclusionSuggestionaboutimprovementonunreasonablep

7、arameterandstandardofvirusinactivationismade,cultivatetargetvirusdirectlyfromfinalproductbyappropriatecellormethodtomonitoringviralsafetyofbloodplasmaproductisadvanced.Keywordsbloodplasmaproduct;viralinactivation;kinetics為了系統(tǒng)性的分析與比較血液制品的病毒滅活方法與效果，科學性的評價與改進不合理的滅活參數(shù)，四川遠大蜀陽藥業(yè)有限公司查閱了委托中國藥品生物制品檢定所與中國人民解放

8、軍艾滋病檢測實驗室對人血白蛋白（檢02第731號）、狂犬病人免疫球蛋白（檢06第1643號、軍第B06005號）、靜注人免疫球蛋白（軍第B06002號、軍第B06003號）、靜注人乙肝免疫球蛋白（檢06第1521號）、人纖維蛋白原（檢04第2720號）與人凝血因子（檢04第2721號）等6類血液制品分別采用巴氏（60±0.5，10h）、低pH孵放（pH4.1±0.3,24±1，孵放21d）、pH4.9/巴氏、S/D（0.3%TNBP,1.0%Tween-80；25±1；6h）、干熱（100、30min）5種病毒滅活方法對水皰性口炎病毒、黃熱病毒、脊髓灰質

9、炎病毒、偽狂犬病毒、腦心肌炎病毒、人類免疫缺陷病毒6個指示病毒的滅活驗證報告。單純的以樣品滅活前后病毒下降數(shù)量來比較，雖然可以說明病毒滅活效果，但特定因子滅活病毒效率的科學性評價需要時效動力學曲線來衡量。基于這樣的理由，本文根據(jù)上述病毒驗證報告資料，系統(tǒng)地整理、統(tǒng)計與制作了病毒滅活曲線圖并進行分析，現(xiàn)將結果報告如下。1材料與方法1.1人血白蛋白（humanalbumin）1.1.1巴氏滅活病毒條件60±0.5，10h。1.1.2樣品參數(shù)連續(xù)3批半成品，蛋白含量：20%，pH7.0；送檢批號：20011134、20011135、20011236。1.1.3指示病毒、毒液基礎滴度水皰性口

10、炎病毒（vesicularstomatitisvirus，VSV,Indiana株），8.25LgTCID50/ml（半數(shù)培養(yǎng)感染劑量，50tissuecultureinfectivedose,TCID50）；辛德畢斯病毒（Sindbisvirus，Sindbis），7.56LgPFU/ml（蝕斑形成單位，plaqueformingunit，PFU）。1.1.4試驗與對照樣品試驗樣品（巴氏滅活）、對照樣品（70存放）；按91的比例在樣品中加病毒液（273ml/批）,按1.2ml/管分裝7個取樣點、重復2次的檢測樣品數(shù)量。1.1.5樣品滅活病毒方法與樣品取樣時間點留取零時樣品后，樣品置59.96

11、0.3水浴振搖，在10h觀察時間內分6次在規(guī)定的時間點取樣。1.1.6取樣保存所有樣品取樣后立即70凍存?zhèn)錅y。1.1.7滴定方法、最低檢測限、培養(yǎng)細胞VSV：96孔細胞病變法、0.5LgTCID50/0.1ml、VERO細胞（非洲綠猴腎傳代細胞株,africangreenmonkeykidneycellline，VERO）；Sindbis：6孔盤蝕斑法（結晶紫染色）、未標注、BHK-21細胞（幼倉鼠腎細胞，babyhamsterkidney,VHK）。每批樣品須至少重復測定2次，對病毒滴定陰性的樣品盲傳三代。1.2狂犬病人免疫球蛋白（humanrabiesimmunoglobulin,HRIG

12、）1.2.1低pH孵放滅活病毒條件pH3.84.4,2325孵放21d。1.2.2樣品參數(shù)連續(xù)生產的三批半成品（低pH孵放前），蛋白5961g/L,pH4.1，4存放，送檢批號：20050703、20051104、20051205。1.2.3指示病毒、毒液基礎滴度VSV8.38LgTCID50/ml；Sindbis7.24LgPFU/ml；HIV8.5LgTCID50/ml（人類免疫缺陷病毒,humanimmunodeficiencyvirus,HIV，B株）。1.2.4試驗與對照樣品VSV與Sindbis試驗樣品（pH4.1）、對照樣品（按5.5ml酸性樣品加1mol/L的NaOH0.127

13、ml的比例調整至pH7.0）。按91的比例在樣品中加病毒液（364ml/批）,按1.2ml/管分裝5個取樣點、重復2次的檢測樣品數(shù)量。HIV試驗樣品（樣品+毒液）、陽性對照樣品（培養(yǎng)液+毒液）、陰性對照樣品（樣品+培養(yǎng)液）。按91的比例在樣品（培養(yǎng)液）中加病毒液（培養(yǎng)液）（0.90.1ml/批）,按0.1ml/次分別在5個取樣點取樣。1.2.5樣品滅活病毒方法與樣品取樣時間點留取零時樣品后，樣品置2325孵放21d，在觀察時間內分4次在規(guī)定的時間點取樣。1.2.6取樣的pH調整與保存所有樣品取樣后立即調整pH至中性，70凍存?zhèn)錅y。1.2.7滴定方法、最低檢測限、培養(yǎng)細胞參見1.1.7項，HIV

14、驗證20050703重復檢測3次，MT4細胞，最低檢測限為2.0LgTCID50/ml。1.3靜注人免疫球蛋白（humanimmunoglobulinforintravenousinjection,IVIG）1.3.1低pH/巴氏滅活HIV病毒病毒滅活方法參見1.1.1項,試驗與對照樣品參見1.2.4項。1.3.2低pH孵放滅活HIV病毒病毒滅活方法參見1.2.1項。毒液滴度8.5LgTCID50/ml。1.3.3樣品參數(shù)蛋白含量5%，pH4.1±0.3,送檢批號：2005122107、2005122108、2005122109。1.4靜注人乙肝免疫球蛋白（humanhepatiti

15、sBimmunoglobulinforintravenousinjection,HBIG）1.4.1低pH/巴氏滅活VSV、Sindbis與Polio-1病毒病毒滅活方法參見1.1.1項。1.4.2指示病毒、毒液基礎滴度VSV8.38LgTCID50/ml；Polio-1（脊髓灰質炎病毒,poliovirusesType                 ，Polio-1）9.25LgTCID50/ml（最低檢測限0.5LgTCID50/

16、0.1ml）；Sindbis7.24LgPFU/ml。1.4.3樣品參數(shù)pH4.9,蛋白質含量50g/L,送檢批號：20050602、20050603、20050604。1.5人纖維蛋白原（humanfibrinogen）1.5.1有機溶劑/去污劑(Solvent/Detergent,S/D）S/D滅活病毒方法0.3%TNBP,1.0%Tween-80；25±1；6h。（1）樣品參數(shù)：纖維蛋白原（S/D法前取樣、-20保存），蛋白含量18g/L、pH7.0、TNBP0.3%、Tween-801.0%，送檢批號：20031020、20031021、20031022。（2）指示病毒、毒液

17、基礎滴度：PRV（偽狂犬病毒,pseudorabiesvirus，PRV）8.88LgTCID50/ml；Sindbis7.64LgPFU/ml。（3）試驗與對照樣品：按試驗樣品（S/D+病毒）、對照樣品（病毒）、終止對照樣品（S/D+稀釋液）的設置與比例分別加S/D至0.3%與1.0%、病毒液或稀釋液（91），每批樣品的終體積為10ml。（4）樣品滅活病毒方法與樣品取樣時間點：留取1.2ml零時樣品后，樣品置25±1水浴振搖，在6h觀察時間內分6次在規(guī)定的時間點取樣（終止對照僅取6h樣品）。（5）取樣的稀釋、過濾、分裝與保存：所有樣品取樣1.2ml,立即用含4%小牛血清的細胞培養(yǎng)液

18、以1100稀釋,過濾除菌，分裝，70凍存?zhèn)錅y。每批樣品須至少重復測定2次。（6）滴定方法、最低檢測限、培養(yǎng)細胞：VSV：96孔細胞病變法、0.5LgTCID50/0.1ml、VERO細胞；Sindbis：6孔盤蝕斑法（結晶紫染色）、未標注、BHK-21細胞。1.5.2干熱滅活病毒方法100、30min。恒溫水浴加熱。（1）樣品參數(shù)：纖維蛋白原中間品（20ml/瓶、-20保存），蛋白含量18g/L、pH7.0、送檢批號：20031020、20031021、20031022。每批24瓶樣品試驗前25水浴融化，按91加病毒液后分裝（20ml/瓶），每批樣品的終體積為200ml，70凍存，凍干。（2）

19、指示病毒、毒液基礎滴度：PRV8.62LgTCID50/ml；Sindbis7.43LgPFU/ml；EMCV7.38LgTCID50/ml（腦心肌炎病毒，encephalon-yocarditisvirus,EMCV）。（3）試驗與對照樣品：試驗樣品（凍干后加熱）、對照樣品（凍干前、后不加熱）。（4）樣品滅活病毒溫度與樣品取樣時間點：留取凍干前、后樣品后，樣品置98.8102.2水浴恒溫加熱，在30min觀察時間內分3次在規(guī)定的時間點取樣。（5）取樣的保存：所有樣品取樣后70凍存?zhèn)錅y。每批樣品須至少重復測定2次。（6）滴定方法、最低檢測限、培養(yǎng)細胞：PRV：96孔細胞病變法、0.5LgTCI

20、D50/0.1ml、PK-15細胞（豬腎細胞,pocinekidneycells,PK-15）；Sindbis：6孔盤蝕斑法（結晶紫染色）、未標注、BHK-21細胞；EMCV:96孔細胞病變法、未標注、VERO細胞。1.6人凝血因子（humancoagulationfactor）1.6.1S/D滅活病毒方法病毒滅活方法參見1.5.1項。樣品參數(shù)：凝血因子（S/D法前取樣、-20保存），蛋白含量16g/L、pH7.0、TNBP0.3%、Tween-801.0%，送檢批號：20031001、20031002、20031003。指示病毒、毒液基礎滴度：PRV9.12LgTCID50/ml；Sindb

21、is7.34LgPFU/ml。1.6.2干熱滅活病毒方法病毒滅活方法參見1.5.2項。樣品參數(shù)：凝血因子（10ml/瓶，凍干品），蛋白含量16g/L、pH7.0、TNBP0.3%、Tween-801.0%，送檢批號：20031001、20031002、20031003。指示病毒、毒液基礎滴度：PRV8.26LgTCID50/ml；Sindbis7.28LgPFU/ml；EMCV7.38LgTCID50/ml。1.7病毒滴度計算方法按Karber法計算。1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計與滅活病毒動力曲線圖使用Casio計算器統(tǒng)計以上3批樣品7個取樣點的殘余病毒滴度均值、標準差與各取樣時間點合并的變異系數(shù)（coef

22、ficientofvariation,CV），采用電腦Office程序、Excel2003圖表軟件制作滅活病毒動力曲線圖，3批間病毒殘余數(shù)量變異系數(shù)5%時,距病毒滴定陰性時限終端2個安全系數(shù)設置病毒滅活工藝時限（technicaltimelimitofvirusinactivation,TTI）。2結果2.1人血白蛋白巴氏滅活VSV與Sindbis病毒見圖1。圖1白蛋白巴氏滅活病毒動力曲線從圖1可看出，在1h內，白蛋白殘存VSV與Sindbis病毒很快降低至最低檢測限，CV分別是2.9%、2%，TTI分別是1h、2h,滅活病毒的數(shù)量6Log,說明該方法滅活病毒效果佳。2.2HRIG低pH滅活V

23、SV與Sindbis病毒見圖2。從圖2可看出，在21d內，在pH7.0時，HRIG殘存VSV下降1.66Log（6.24.54）,在pH4.0時，HRIG殘存VSV與Sindbis病毒緩慢降低至最低檢測限，滅活病毒的數(shù)量6Log,CV分別是3.27%、3%，TTI分別是14d、28d,說明該方法滅活病毒效果較好。2.3HRIG低pH滅活HIV病毒見圖3。圖3HRIG低pH滅活HIV動力曲線從圖3可看出，在21d內，在pH7.0時,HRIG殘存HIV下降3.94Log（8.334.39）,在pH4.0時HRIG殘存HIV緩慢降低至最低檢測限，滅活病毒的數(shù)量6Log,CV是3.8%，TTI是14d

24、,說明就HRIG而言，pH4.0與pH7.0對HIV的存活時間雖然存在差異但意義不大，HIV對特定環(huán)境抵抗力很差。2.4IVIG低pH/巴氏滅活HIV病毒見圖4。圖4IVIG低pH/巴氏滅活HIV動力曲線從圖4可看出，在4h內，IVIG殘存HIV病毒降低至最低檢測限，滅活病毒的數(shù)量6Log,CV是0，TTI是8h,說明該方法滅活病毒效果很好。與-70對照樣品比較HIV對熱因子非常敏感。2.5IVIG低pH滅活HIV病毒見圖5。圖5IVIG低pH滅活HIV動力曲張（d）從圖5看出，在21d內，在pH7.0時IVIG殘存HIV下降3.94Log（8.334.39）,在pH4.0時IVIG殘存HIV

25、緩慢降低至最低檢測限，滅活病毒的數(shù)量6Log。CV分別是3.7%、3.1%，TTI分別是14d、28d,說明就IVIG而言，pH4.0與pH7.0對HIV的存活時間雖然存在差異，但意義不大，HIV對特定環(huán)境抵抗力很差。2.6HBIG低pH/巴氏滅活VSV、Sindbis與Polio病毒見圖6。圖6HBIG低pH/巴氏滅活病毒動力曲線從圖6可看出，在0.5h內，HBIG殘存VSV、Sindbis與Polio病毒降低至最低檢測限，滅活病毒的數(shù)量6Log,CV分別是4.3%、3.6%與3.6%，TTI分別是0.5h、1h與1h,說明該方法滅活病毒效果很好（與圖1與圖4的結果相似）。2.7纖維蛋白原S/D滅活PRV、Sindbis病毒見圖7。