1、氨磺必利是一種有效的5-HT7拮抗劑與其體內抗抑郁作用有關Abbas AI, Hedlund PB, Huang XP, Tran TB, Meltzer HY, Roth BL摘要背景 在歐洲許多國家，臨床上氨磺必利已被批準用于精神分裂癥的治療，而在意大利，治療適應癥還包括：惡劣心境和輕度抑郁障礙。諸多臨床研究結果提示，氨磺必利能有效治療重性抑郁障礙。一直以來，大家認為氨磺必利抗抑郁、抗精神病的核心機制是其能夠調節多巴胺功能，可選擇性拮抗D2/D3受體。目的 本研究的目的旨在探索氨磺必利的抗抑郁效應是否受與其它受體相互作用的脫靶效應所調節。材料與方法 我們完成了如下實驗：（1）氨磺必利對大量

2、中樞神經系統分子靶點的藥理學分析；（2）尋找5-HT7a受體的高效親和拮抗劑，繼而觀察氨磺必利對野生型和5-HT7受體敲除小鼠的抗抑郁療效。結果 本研究發現，氨磺必利是一種有效的5-HT7a受體競爭性拮抗劑，并與其它的分子靶點沒有相互作用，這點也許能夠解釋該藥在體內抗抑郁作用的機制。特別是與野生型同胞不同之處在于：在懸尾實驗和強迫游泳實驗這兩種經典的抑郁癥嚙齒類動物模型中，氨磺必利對5-HT7受體敲除小鼠無治療效應。結論 氨磺必利的抗抑郁作用可能與5-HT7a受體拮抗有關，而并非氨磺必利對D2/D3受體拮抗所致。關鍵詞： 氨磺必利；5-HT7；5-HT7受體拮抗劑；抗抑郁藥物；非典型抗精神病藥

3、物；DAN2163 前言氨磺必利是一種苯甲酰胺衍生物。作為選擇性D2/D3受體拮抗劑，它起初被開發用于治療精神分裂癥（Perrault et al. 1997）。大量的臨床試驗證明，與其它抗精神病藥物相比，氨磺必利治療精神分裂癥顯示出療效相當或更為有效（Racagni et al. 2004）。薈萃分析結果顯示，氯氮平、氨磺必利、利培酮、奧氮平比第一代（典型）抗精神病藥物和其它非典型抗精神病藥療效更顯著（Davis et al. 2003; Leucht et al. 2009）。在臨床實際使用過程中發現，氨磺必利EPS發生率較低，這也是其最類似于一種非典型抗精神病藥物的地方（Leucht e

4、t al. 2002）。但與利培酮及典型抗精神病藥物類似，氨磺必利由于有較強的D2/D3拮抗特作用，致使血清催乳素水平明顯升高（Wetzel et al. 1998）。氨磺必利表現出D2受體高親和力和5-HT2A低親和力，這種藥理學特性使之類似于典型抗精神病藥物，然而在治療方面，它卻更像一種非典型抗精神病藥物。研究顯示，氨磺必利能夠改善精神分裂癥患者的注意力、執行功能、工作記憶、總體認知指數以及陳述性記憶（Deeks and Keating 2008; Mortimer et al. 2007）。但可能會損害正常人群的識別記憶功能（Gibbs et al. 2008; Mortimer et

5、al. 2007）。有趣的是，在治療精神分裂癥和其它精神障礙的過程中，氨磺必利表現出抗抑郁效應（Kim et al. 2007; Montgomery 2002）。在意大利，氨磺必利已獲準用于治療惡劣心境，被認為是一種高效抗抑郁劑（Montgomery 2002）。事實上，Lecrubier等使用蒙哥馬利和阿斯伯格抑郁癥評估量表，對氨磺必利和丙咪嗪治療惡劣心境、重性抑郁障礙進行了療效比較，結果顯示兩者療效相當（Lecrubier et al. 1997）。另外一項研究比較了氨磺必利和氟西汀治療重性抑郁障礙、惡劣心境的療效，結果顯示兩組等效（Smeraldi 1998），而且兩組的有效率、不良事

6、件數量以及脫落率也相當。實際上，至少已有6項臨床研究表明，氨磺必利治療惡劣心境和/或重性抑郁障礙的療效與陽性對照藥物類似（Racagni et al. 2004）。學者們普遍推測，對多巴胺信號的調節是氨磺必利抗抑郁效應的核心基礎，這種推論主要源于該藥能選擇性拮抗D2/D3受體。事實上，多巴胺系統在抗抑郁效應中似乎在扮演一定的角色。許多不同種類的抗抑郁藥物，包括氟西汀、氟伏沙明和去甲丙咪嗪，均能夠增加大鼠前額葉皮質細胞外的多巴胺含量（Tanda et al. 1994; Jordan et al. 1994; Bymaster et al. 2002）。另一方面，舒必利另一種苯甲酰胺衍生物，也能

7、選擇性拮抗D2/D3受體，當將其注入強迫游泳實驗的大鼠雙側伏核，而非尾狀殼核時，會顯著降低去甲丙咪嗪的抗抑郁效應（Cervo and Samanin 1987）。盡管舒必利在人體上表現出抗抑郁作用，但與阿米替林相比卻弱很多（Drago et al. 2000）。總之，除了氨磺必利，其它苯甲酰胺類藥物與5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs）以及三環類抗抑郁藥相比，未被確認具有抗抑郁效應。盡管有較為確切的證據表明，某些抗抑郁藥物能夠調節多巴胺系統，但除了上述一些現象學數據，并無直接證據顯示選擇性多巴胺受體拮抗劑（如氟哌啶醇）在單一治療時具有抗抑郁效應，而且在該種情況下，其它靶點并未受到影響。另外，阿

8、立哌唑被批準用于抑郁癥的聯合治療，但它對抗抑郁劑起效過程中所涉及到的許多生物胺受體和轉運蛋白均無靶標作用（Shapiro e al. 2003）。部分研究顯示，抗抑郁藥物聯合奧氮平能夠有效治療難治性抑郁或雙相抑郁障礙（Deeks and Keating 2008）。另外，喹硫平通過其主要代謝產物N-脫烴喹硫平（去甲喹硫平）有效抑制去甲腎上腺素轉運蛋白，從而發揮抗抑郁效應，這個過程并未包含對多巴胺受體的任何直接作用。因此，我們試圖驗證氨磺必利的抗抑郁效應是否源于其對D2/D3受體的拮抗。通過篩選氨磺必利在中樞神經系統中的大量靶點，旨在分析和識別其抗抑郁作用的機制。材料和方法放射性配體結合分析放射

9、性配體購于Perkin-Elmer 及GE醫療保健中心。使用轉染或穩定表達的細胞膜進行競爭性結合分析，其詳細制備過程如既往研究所描述（Shapiro et al. 2003; Roth et al. 2002），且供在線查詢（）。表1羅列了關鍵信息，例如放射性配體成分和濃度、溫育緩沖液和溫育時間，額外信息可在線查詢（/UNC-CH%20 Protocol%20Book.pdf）。Schild 分析穩定表達5-HT7a受體的細胞置于白色OptiPlate-96孔板（Perkin-Elmer）中培養過夜，使用含

10、1%透析胎牛血清的DMEM培養基，每孔10,000個細胞。然后代之以測定培養基（DMEM培養基含2mM異丁基甲基黃嘌呤以及10 mg/100 ml抗壞血酸）在37預溫育30分鐘；上述測定培養基中每孔5µL的氨磺必利按10倍稀釋成7種終濃度（0、1、3、10、30、100和300nM）；5分鐘后，每孔5µL的5-HT按10倍稀釋成8種終濃度（0、3、10、30、100、300、1000和3000nM）。該分析用于在沒有氨磺必利以及不斷增加氨磺必利的環境中，繪制5-HT劑量-反應曲線。反應過程在37條件下進行30分鐘。使用GE公司的HitHunter cAMP XS試劑盒測定c

11、AMP含量，方法同使用說明書。簡言之，在30分鐘反應的終末加入cAMP抗體，之后再立即加入Galacton-Star、Emerald-II、裂解液和cAMP XS+ED試劑以1:5:19:25的比例配制成的混合液。室溫溫育1小時后加入cAMP XS+EA試劑，然后置于室溫溫育1小時。使用標準-粒子計數器讀取發光信號，并采用微軟Excel以及科學圖形計算軟件Graphpad Prism進行數據處理。在Graphpad Prism中，球形擬合與Hill方程結合的改良Gaddum/Schild模型（Motulsky and Christopoulos 2004）。殘差平方和的F檢驗用于判斷Schil

12、d和Hill斜率是否顯著不同于整體。實驗動物實驗動物為1012周的雄性5-HT7-/-小鼠及其5-HT7+/+雄性同胞對照。5-HT7-/-小鼠品系的來源在既往研究已有描述（Hedlund et al. 2003）。本研究所用之小鼠在C57BL6J的背景下至少回交16代。所有行為學實驗始于09:00AM。小鼠處于24小時晝夜循環中（白天06:00AM開始，18:00PM結束），自由進食進水。所有的實驗均遵循美國國立衛生研究院頒布的實驗動物照護與使用指南，并獲得斯克利普斯研究機構動物照護與使用委員會的批準。實驗中盡量減少實驗用動物數量，并減輕其痛苦。懸尾實驗懸尾實驗的步驟參考既往研究（Hedlu

13、nd et al. 2005）。用黏帶將小鼠的尾部固定在離臺面50cm的金屬桿上。為便于與既往研究進行比較，實驗持續6分鐘，在后4分鐘計算小鼠不動時間。不動定義為沒有任何肢體或軀干運動，但應排除呼吸運動。強迫游泳實驗強迫游泳實驗的步驟同既往研究所描述（Hedlund et al. 2005）。將小鼠輕輕放在一個直徑16cm，高度25cm的圓形塑料水缸里，水缸中注入25°C潔凈水至水深10cm。實驗持續6分鐘，最后4分鐘計算小鼠不動時間。不動定義為在水中沒有任何水平或垂直運動，除外小鼠為將頭部保持在水面以上而產生的小幅度運動。每只動物進行實驗前均會換水。 藥物治療懸尾實驗和強迫游泳實驗

14、前30分鐘進行腹腔內注射。氨磺必利購自于Sigma-Aldrich公司。將藥物溶解于以0.9%NaCl溶液配制成的50mM酒石酸中，注射的總體積為0.2ml。溶媒作為空白對照。數據分析所有數據以均數±標準誤（SEM）來表示。基因型和/或藥物治療之間的差異采用雙因素方差分析，基因型和藥物治療各作為一個因素。方差分析之后采用Bonferroni法校正。使用GraphPad Prism軟件包進行統計學分析；P<0.05為差異具有統計學意義。結果氨磺必利對人5-HT7a受體具有高親和力為明確氨磺必利抗抑郁作用的藥理機制，我們采用受體組分析方法篩選了大量潛在靶點（Armbruster a

15、nd Roth 2005; Table 1），并證實氨磺必利是一種有效的選擇性作用于D2/D3受體的藥物。氨磺必利對這兩種受體的抑制常數Ki分別為（3±1）nM和（3.5±0.5）nM。然而該藥物對于另外兩種我們以前尚未確認的靶點也有較高的親和力，分別是5-HT2b和5-HT7a受體。氨磺必利對5-HT2b受體的抑制常數Ki為（13±1）nM，與氚 麥角酸二乙胺（3HLSD）競爭結合5-HT7a受體的抑制常數Ki為（11.5±0.7）nM，而3HLSD與5-HT7a受體的平衡解離常數為6.6nM（Shen et al. 1993; Roth et al.

16、 1994; Fig.1）。另外，氨磺必利對h5-HT1A受體以及對其它與抗抑郁藥物藥理機制有關的分子靶點親和力低（Roth et al. 2004）。氨磺必利是一種有效的人5-HT7a受體拮抗劑最初的篩選證實了氨磺必利對人5-HT7a受體具有高親和性。已知嚙齒類動物和人類具有多種5-HT7受體的剪接變異體，但是5-HT對它們的親和力和效能卻沒有差別。在大鼠體內，迄今為止最常見的亞型是5-HT7a（Heidmann et al.1998）。鑒于藥物對不同的5-HT7剪接變異體具有一致的藥理學特性，于是我們使用氨磺必利將其全部篩選后，著重研究了被高度表達的5-HT7a變異體。通過另一個競爭性分析

17、，我們對自己的研究發現將加以詳細說明。此次氨磺必利與3H5-CT競爭結合5-HT7a受體；后者對5-HT7a受體具有亞納摩爾級親和力（Thomas et al. 1998; To et al. 1995; Fig. 2）。3H5-CT優先標記高親和力、激動劑結合位點，而3HLSD作為較弱的部分激動劑，則主要標記低親和力、拮抗劑結合位點。我們推測，如果氨磺必利是5-HT7a受體的拮抗劑，它將優先削弱3H5-CT標記位點的親和力。事實上，氨磺必利對3H5-CT標記的5-HT7a受體親和力非常低（Ki=135.5±15.8 nM），這說明了它是拮抗劑。前一部分研究表明氨磺必利不會誘導cAM

18、P堆積也證實了這一論點（數據未列出）。然后，在沒有以及不斷增加氨磺必利濃度的環境下，繪制5-H T激動5-HT7a受體的劑量-反應曲線，之后采用最小二乘法非線性回歸來球形擬合改良Gaddum-Schild方程的量效曲線（Motulsky and Christopoulos 2004）。由圖可見，隨著氨磺必利濃度的不斷增加，量效曲線平行右移，表明氨磺必利是一種可逆的競爭性拮抗劑（Fig.3）。殘差平方和的F檢驗顯示Schild斜率與1沒有顯著差異，表明氨磺必利是5-HT7a受體的競爭性拮抗劑。由球形擬合Gaddum-Schild方程所得的競爭性拮抗劑拮抗參數（7.94±0.08）估算平

19、衡解離常數Kd為（11.4±0.8）nM，這與我們之前對3HLSD標記的受體位點抑制常數親和力估算相一致。因而，氨磺必利對5-HT7a受體而言，是一種高親和力的競爭性拮抗劑。5-HT7受體調節氨磺必利在體內的抗抑郁效應既然5-HT7a受體是氨磺必利在體內的新靶點，那么5-HT7受體有可能是其發揮抗抑郁作用的基礎。如果是這樣，那么氨磺必利對于5-HT7/小鼠則缺乏抗抑郁效應。既往有報道（Hedlund et al. 2005；Guscott et al.2005），在懸尾實驗（TST）和強迫游泳實驗（FST）中，如僅注射溶媒，5-HT7/小鼠比5-HT7+/+小鼠的不動時間更短。盡管兩

20、種抑郁癥模型中氨磺必利的有效劑量不同，但是氨磺必利在5-HT7+/+小鼠中的量效曲線均呈“U”型（Fig.4）。TST中1mg/kg藥物和FST中0.1mg/kg藥物均能縮短5-HT7+/+小鼠的不動時間，這與預期的抗抑郁效應相一致。另一方面，對于5-HT7/小鼠，氨磺必利劑量在TST中低于10 mg/kg，在FST中低于1mg/kg的情況下，對不動時間并無影響，即未表現出抗抑郁效應。當氨磺必利劑量在TST中增至10 mg/kg，FST中增至1mg/kg時，5-HT7/小鼠不動時間顯著延長至5-HT7+/+小鼠的水平，這可能是由高劑量氨磺必利產生的錐體外系反應所致。與之相似的是，高劑量氨磺必利

21、（TST中3mg/kg和10 mg/kg，FST中3mg/kg和1mg/kg）致使原本在5-HT7+/+小鼠中表現出的明確抗抑郁作用消失。氨磺必利這種低劑量抗抑郁作用的特點與臨床研究所報道的結果一致（Racagni et al. 2004）。討論本研究顯示，氨磺必利是一種有效的5-HT7a受體拮抗劑，這也是其具有抗抑郁效應的重要位點。氨磺必利獨特的治療反應很難由其已知的藥理學特性來解釋。研究表明，氨磺必利對突觸前多巴胺自受體具有一定選擇性，特別是在低劑量時選擇性作用于邊緣系統或紋狀體，這一點可能與其治療特點有關（Schoemaker et al.1997）。然而，值得注意的是，氟哌啶醇對突觸前

22、多巴胺自受體具有相似的作用，而事實上，另一種苯甲酰胺衍生物舒必利也表現出同樣的邊緣系統選擇性（Schoemaker et al. 1997）。與氨磺必利相比，盡管舒必利也選擇性作用于D2/D3受體，但它及相關的苯甲酰胺類藥物，如雷氯必利、瑞莫必利和甲氧氯普胺并不與5-HT7受體結合（Roth et al. 1994）。雖然舒必利與氨磺必利的藥理學特點非常相似，但前者在人體內的抗抑郁作用非常微小（Drago et al.2000），不僅如此，當它與抗抑郁劑聯合使用于抑郁癥大鼠模型時，甚至會使大鼠回復至抑郁狀態（Cervo and Samanin 1987）。盡管幾乎沒有證據表明多巴胺能信號調節是

23、氨磺必利發揮抗抑郁作用的充要條件，但抗抑郁劑能夠調節前額葉皮質的多巴胺水平（Tanda et al. 1994），這進一步證明多巴胺在其療效調節方面具有一定的作用。實際上，氨磺必利因其對D2/D3受體的選擇性和臨床上表現出的抗抑郁效應，被認為是唯一只依賴多巴胺能模式而發揮作用的抗抑郁藥。然而，一方面這種調節多巴胺能的藥物對抑郁癥有效，另一方面，其它相關的苯甲酰胺類藥物卻缺乏抗抑郁效果，故推測氨磺必利的抗抑郁作用可能得通過其它的一些靶點來解釋。為尋找迄今為止尚未被確認的氨磺必利的作用靶點，我們對多種克隆受體進行了平行篩選。篩選結果與既往研究相一致（Schoemaker et al.1997），表

24、明氨磺必利相對選擇性地作用于D2/D3受體。除此之外，我們還發現了另外兩種以前未被報道的靶點：5-HT2B和5-HT7a受體。5-HT2B受體激動與心臟瓣膜病變有關（Rothman et al. 2000; Roth 2007; Berger et al. 2009），但諸如氨磺必利等5-HT2B受體拮抗劑（Huang et al.,待發表）則表現安全。目前尚無證據表明5-HT2B受體參與調節氨磺必利的治療作用。另一方面，一直以來，大量研究認為晝夜節律調節、心境、睡眠結構、體溫調節、抑郁行為（Hedlund and Sutcliffe 2004;Bergeret al.2009）的病因學機制，

25、以及抗精神病藥物的作用（Roth et al.1994）均與5-HT7受體有關（Shen et al. 1993; Lovenberg et al. 1993;Bard et al. 1993），進一步提示該受體可能是氨磺必利抗抑郁效應的候選靶點。事實上，本研究也發現氨磺必利是一種有效的5-HT7a受體競爭性拮抗劑，由此推測5-HT7a受體拮抗可能與氨磺必利的抗抑郁效果相關。為檢驗這一假設，我們采用體內實驗的方法，預期氨磺必利對于5-HT7受體基因敲除小鼠無效。結果如預期所示，在懸尾實驗和強迫游泳實驗中，低劑量氨磺必利對5-HT7/小鼠無抗抑郁效應，而對其同胞5-HT7+/+小鼠卻有效。這不太

26、可能是由于5-HT7/小鼠較短的基線不動時間所造成的地板效應，因為SSRI類抗抑郁藥西酞普蘭能減少懸尾實驗中5-HT7+/+和5-HT7/小鼠的不動時間（Hedlund et al.2005）。懸尾實驗中，5-HT7+/+小鼠經氨磺必利治療后，其不動時間約縮短25%，這與既往所報道的5-HT7受體拮抗劑SB269970的效應相一致，然而卻不及西酞普蘭之效果高達50%以上的不動時間縮短率（Hedlund et al. 2005）。最后，高劑量氨磺必利能延長不動時間，這與懸尾實驗中D2/D3受體拮抗劑依替必利所產生的不動時間延長效應相一致（Ferrari and Giuliani 1997），進一

27、步證明D2/D3受體的拮抗作用并不能解釋氨磺必利的抗抑郁效應。因此，在懸尾實驗和強迫游泳實驗兩種最佳的抑郁癥動物模型中，5-HT7受體成為氨磺必利在體內發揮抗抑郁作用的關鍵調節位點。一些以5-HT7受體為靶點的藥物效應研究與我們的假設高度一致。既往研究及本研究均顯示，在懸尾實驗和強迫游泳實驗中，5-HT7/小鼠的不動時間顯著短于5-HT7+/+小鼠（Hedlund et al.2005; Guscott et al.2005），提示減少5-HT7受體信號傳導具有抗抑郁效應。SB269970（一種選擇性5-HT7受體拮抗劑）能縮短懸尾實驗和強迫游泳實驗中5-HT7+/+小鼠的不動時間，而對5-H

28、T7/小鼠無作用（Hedlund et al. 2005）。至少有另一項研究中證實了SB269970在懸尾實驗和強迫游泳實驗中的抗抑郁效應（Wesolowska et al. 2006）。最后，另一種5-HT7受體拮抗劑（SB258719）也被證實能顯著縮短強迫游泳實驗中的不動時間（Guscott et al. 2005）。值得注意的是，長期氟西汀治療能下調下丘腦部位5-HT7受體表達（Sleight et al. 1995; Mullins et al. 1999），伴隨著5-HT7受體信號的改變而逐漸顯現的抗抑郁效應進一步證實，降低5-HT7受體信號傳導有益于治療抑郁癥?？挂钟糁委熡绊懙降?/p>

29、另一個重要生理學參數是睡眠。一直以來，睡眠結構改變被認為與抑郁癥有關。抑郁患者表現出第一次進入快動眼睡眠（REM）的潛伏期縮短，但總REM睡眠時間延長（Brunello et al. 2000）。大多數抗抑郁藥能使睡眠結構正?；黾覴EM睡眠潛伏期并減少總REM睡眠時間（Staner et al. 1999）。諸多研究提示，抗抑郁藥物使睡眠結構正?；哪芰εc抑郁癥患者的臨床療效呈正相關，但也有少部分研究無法重復該結果（Ott et al. 2002）。5-HT7受體拮抗劑SB-656104-A所引起的REM睡眠改變與大多數SSRI類和三環類抗抑郁藥物相一致，即延長REM睡眠啟動的潛伏期以及縮短

30、總REM睡眠時間（Thomas et al. 2003）。此外，5-HT7/小鼠表現出較少的REM睡眠（Hedlund et al. 2005）。有研究表明，5-HT7受體被拮抗可能會影響神經元形態（Kvachnina et al. 2005），刺激海馬神經發生（Nandam et al. 2007;Kodama et al. 2004）或與其它抗抑郁藥產生協同作用（Xu et al. 2006），這與抗抑郁藥物的作用機制相一致，因為部分研究認為抗抑郁藥物的療效與海馬神經發生相關（Santarelli et al. 2003; Malberg et al. 2000），當然也有一些研究并不支持

31、這一觀點（Holick et al. 2008）。因此，如同我們所常用的SSRI類和三環類抗抑郁藥，5-HT7受體拮抗劑也引起了很多相同的生理學改變。普遍認為氨磺必利是通過拮抗D2/D3受體來發揮其臨床上的抗抑郁效應，這主要來自于兩條推論。首先，在藥物前期篩選過程中，氨磺必利表現出對D2/D3受體具有選擇性，提示這個藥物的任何治療作用一定會受到這種機制的調節；其次，大量研究顯示，抗抑郁藥物會影響多巴胺和多巴胺受體，于是推測多巴胺能系統的變化可能是抗抑郁藥物作用機制的重要環節（Dailly et al.2004）。但很多證據卻使氨磺必利通過拮抗D2/D3受體來調節其抗抑郁效應的論點受到質疑。首先

32、，也許也是最主要的，沒有其它D2/D3受體拮抗劑，包括其它苯甲酰胺衍生物，在動物模型和人體中表現出非常有效的抗抑郁作用。其次，盡管很多有力的證據表明抗抑郁藥治療中會伴有多巴胺能的變化，但并不意味著這種現象是抗抑郁藥物起效的關鍵性因素。本研究證實了氨磺必利能夠阻斷5-HT7a受體，這可能可以解釋該藥物的抗抑郁作用。研究顯示慢性抗抑郁藥治療能夠引起5-HT7受體功能變化（Sleight et al. 1995; Mullins et al. 1999）。此外，懸尾實驗和強迫游泳實驗中，與其同胞相比，5-HT7/小鼠不動時間較短（Hedlund et al. 2005; Guscott et al. 2005）。5-HT7a受體拮抗劑對抑郁癥動物模型有效（Hedlund et al. 2005），并且對睡眠結構具有同大多數抗抑郁藥物一樣的效應（Hedlund