1、實時熒光定量PCR的應用 楊陽 2.11-08-31主要內容第一部分：PCR簡介第二部分：RNA的提取第三部分：RT第四部分：實時熒光定量PCR第五部分：數據分析第六部分：誤差校正第七部分：常見問題分析第一部分：PCR簡介PCR技術的發明vv 1985 1985年年Kary.B.MullisKary.B.Mullis教教授發明了具有劃時代意義的授發明了具有劃時代意義的PCRPCR技術。技術。PCR Polymerase Chain Reaction vvPCR (PCR (聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應) )技術是一種體外快速擴技術是一種體外快速擴增特定增特定DNADNA片段的方法。片段的方法。

2、 vv 是一個在引物介導下反復進行熱變性、退火、是一個在引物介導下反復進行熱變性、退火、引物延伸三個步驟而擴增引物延伸三個步驟而擴增DNADNA的循環過程。的循環過程。 vv運用運用PCRPCR技術能快速特異地擴增所希望的目的技術能快速特異地擴增所希望的目的DNADNA片段，使皮克片段，使皮克(Pg(Pg，10101212）起始物達到）起始物達到微克（微克（gg，10106 6）水平。）水平。2.PCR原理PCR類型 RT-PCR 兼并引物PCR 巢式PCR 反向PCR 不對稱PCR 原位PCR 重組PCR 熒光定量PCR 錨定PCR 多重PCR 定量PCR 實時熒光定量PCR技術real-t

3、ime fluorescent quantitativePCRFQ-PCR 是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法，實現了PCR從定性到定量的飛躍。 實時熒光定量PCR技術分類 熒光探針 Beacon法：以美國人Tagyi為代表 TaqMan探針:以美國ABI公司為代表 FRET技術:以羅氏公司為代表 熒光染料 飽和熒光染料: EvaGreen、LC Green 非飽和熒光染料:SYBR Green 第二部分：RNA的提取提RNA基本步驟標本Trizol異丙醇75%乙醇DEPC水溶解氯仿RNA的抽提注意事項

4、 所有用具去RNase處理 戴口罩、帽子，勤換手套，防外源RNase污染 盡量快速 4 離心：室溫會導致不適當分層，從而導 致變異RNA產物。一、標本的處理 新鮮、低溫保存、避免反復凍融。易至RNARNA降解，提取量下降。二、勻漿：TrizolTrizol 裂解細胞，使核蛋白體解離，釋放RNARNA；抑制RNaseRNase活性；酸性酚使RNARNA進入水相。 過多：上清液變為紅色，浪費。 過少：未加氯仿前即分層。 裂解不充分， RNaseRNase抑制不充分，得率低，RNARNA完整性、純度受損。三、抽提、分層：氯仿 變性蛋白，抽提去除過多的酚，加速有機相與水相的分層。 過少：上述作用減弱，

5、影響RNA質量。 過多：使DNA和蛋白進入水相，影響RNA質量。四、沉淀：異丙醇 過多：會沉淀鹽和其他污染物，使用乙醇不能洗脫。五、洗滌： 75%75%乙醇 去鹽作用，根據情況可重復幾次。六、溶解： DEPCDEPC水 掌握溶解時間。 太早：沉淀物太濕，含有乙醇會影響后續反應。 太遲：沉淀物太干，不易溶解。 RNA的抽提注意事項標本Trizol異丙醇75%乙醇DEPC水溶解氯仿4：過夜-70 ：一個月4：過夜-20 ：時間長會使鹽沉淀 4：1周-20 ：1年 -70 ：1年以上RNA得率檢測分光光度計 260nm:核酸 280nm:蛋白等有機體 230nm:雜質濃度 320nm:溶液渾濁度總R

6、NA濃度（ng/l） =OD26040稀釋倍數（ng/l） OD 260讀數介于0.11.0之間可靠 （203200 ng/l ）RNA的質量RNA的質量 RNA完整性鑒定 第三部分：RT RT反應體系RNA 1gPrimer 1L5Reaction Buffer 4L RNase inhibitor（20U/L） 1L10mM dNTP mix 2L Reverse Transcriptase（200U/L)1LDEPC-treated water up to 20L RT引物的選擇是一系列寡核苷酸片段是一系列寡核苷酸片段的混合物，它含有各種的混合物，它含有各種可能的核苷酸排列順序，可能的核

7、苷酸排列順序，因此可與任意核酸序列因此可與任意核酸序列雜交。雜交。RT反應條件 25,5min ；(隨機引物加此步) 42,60min； 70,5min。RT反應的注意事項冰上操作冰上操作配制混合液配制混合液試劑短暫離心試劑短暫離心移液槍：用完之后要歸到最大計量的位移液槍：用完之后要歸到最大計量的位 置，防止久而久之彈簧失去彈性置，防止久而久之彈簧失去彈性 。 第四部分：實時熒光定量PCRSY法-PCR反應基本組分vv DNA Polymerase DNA DNA Polymerase DNA聚合酶聚合酶vv dNTP dNTP 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸v Buffer Buffer 緩沖

8、溶液緩沖溶液v rox rox 內參染料內參染料v SYBR Green SYBR Green 熒光染料熒光染料vv Primer F/R Primer F/R 引物（上游引物（上游/ /下游）下游）vv Template Template 模板模板MixPCR實驗操作注意事項vv冰上操作冰上操作vv配制混合液配制混合液vv試劑短暫離心試劑短暫離心vv防止污染：分區操作防止污染：分區操作vv移液槍：用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性移液槍：用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性 。PCR反應條件 95，10min； 95，15sec， 60，30sec， 7

9、2，30sec， 反應結束后，立即進行溶解曲線分析。 95，15sec， 60，60sec， 95，15sec， 60，15sec。for 40 cycles 第五部分：數據分析結果： 擴增曲線擴增曲線 熔解曲線熔解曲線標本陰性陰性標本理論擴增曲線理論擴增曲線實際擴增曲線實際擴增曲線PCR擴增曲線RnRn（Normalized reporterNormalized reporter）：是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光）：是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。發射強度的比值。 RnRn：RnRn是是RnRn扣除基線后得到的標準化結果（扣除基線后得到的標準化結果（

10、Rn=Rn-Rn=Rn-基線）。基線）。TmTm值：雙鏈DNA解鏈50%的溫度。數據分析：相對定量：不用得到絕對的拷貝數，只需計算表達差異相對定量：不用得到絕對的拷貝數，只需計算表達差異即可，得到的結果是某基因表達水平升高了或降低了即可，得到的結果是某基因表達水平升高了或降低了多少倍。多少倍。2 -CT 表示實驗組目的基因表達相對于對照組變化的倍數。表示實驗組目的基因表達相對于對照組變化的倍數。 Ct =Ct 目的- Ct 內參 Ct = Ct實驗組- Ct 對照組 第六部分：誤差校正 模板方面的誤差模板方面的誤差：IPC校正 取樣量即細胞數量、抽提效率、純化損失、反轉錄效率等 操作誤差操作誤

11、差：ROX校正 試劑取用誤差的主要部分、受耗材質量及儀器等影響而產生的熒光激發波動 其余誤差其余誤差：統計校正 重復實驗，取平均值總結 設計合格的引物。設計合格的引物。 適當濃度的模板。適當濃度的模板。 設定內參和陰性對照。設定內參和陰性對照。 使用合適的使用合適的ROX。 實驗時做復孔。實驗時做復孔。 冰上操作。冰上操作。第七部分：常見問題分析問題1：無 Ct 值出現檢測熒光信號的步驟有誤: 一般 SG 法采用 72延伸時采集。引物或探針降解: 可通過 PAGE電泳檢測其完整性。 模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。 模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的

12、情況。問題2： Ct 值出現過晚 擴增效率低: 反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三 步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。 PCRPCR 產物太長: 一般采用 80-150bp 80-150bp 的產物長度。PCRPCR 各種反應成分的降解或加樣量的不足。 模板量低。問題3：陰性對照有信號MixMix或水被污染。如使用ROXROX校正，則可能為ROX ROX 降解所致。引物二聚體的出現：3535循環后出現屬正常，配合熔解曲線進行分析 提高退火溫度；降低引物濃度；冰上操作；重新設計引物 問題4：溶解曲線不止一個主峰引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。 引物

13、濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。 模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組 DNA的引入，或通過引物設計 避免非特異擴增。cDNAcDNA為為1 1：5 5 引物終濃引物終濃100nm100nmcDNAcDNA為為1 1：5 5 引物終濃引物終濃50nm50nm問題5：重復性差1.加樣不準確。 2.儀器在樣品上溫度條件有差異，即溫度均一性不好。 3.模板濃度低。樣品初始濃度越低，重復性越差，應減少樣品的稀釋倍數。 問題6：熔解曲線只有上升支擴增產物的Tm值較高，設置熔解曲線時改9595度為9999度。99.0問題7：擴增曲線異常基線設置有誤。高濃度的模板會導致CTCT值過早出現，即基線范圍變小，導致機器讀取熒光數值有誤。問題8：擴增熔解曲線不同，ct值卻相同模板起始濃度相同，擴增效率不同。問題9：ct值不同，熔解曲線同，擴 增曲線還高模板起始濃度不相同，擴增效率基本相同。問題10：預實驗時為單峰，正式時為雜峰。cDNA為為1：5 引物終濃度引物終濃度50nmcDNA為為1：10 引物終濃度引物終濃度50nmcDNA為為1：5 引物終濃度引物終濃度100nmcDNA為為1：5 引物終濃