1、細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 多年來人類一直在進(jìn)行著抗腫瘤藥物的研究，如何合理有效地篩選藥物是整個(gè)研究過程中很重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。 上世紀(jì)80年代中期以前，普遍采用體內(nèi)小鼠白血病P388和L1210模型作為第一輪初篩，其明顯的缺陷是會(huì)相當(dāng)一部分有活性的藥物會(huì)被淘汰。 1985年之后，開始采用體外代表各種常見實(shí)體瘤的人類腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行初篩，優(yōu)勢有：高通量，覆蓋面大；所需量少，尤其適合復(fù)雜天然產(chǎn)物提取物。 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)是初篩時(shí)普遍使用的方法之一，有快速、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。 藥物療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)合成化合物/植物提取物純品的半數(shù)抑制濃度IC5010g/mL，或者植物粗提物的IC5010g/mL，并且有細(xì)胞毒性

2、的劑量依賴關(guān)系，且最高抑制效率達(dá)80%以上，則判定樣品在體外對細(xì)胞有殺傷作用。n細(xì)胞：HeLan試劑：二甲亞砜（DMSO） 二甲基亞砜(DMSO)是目前最好的滲透型細(xì)胞凍存保護(hù)劑，但也是一種對細(xì)胞毒性很大的化學(xué)試驗(yàn)劑。在深低溫(零下200度)保存細(xì)胞時(shí)凍存過程中，DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，降低冰點(diǎn)、延緩凍存過程，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少細(xì)胞損傷。低溫時(shí)二甲基亞砜的細(xì)胞毒性受到抑制。n技術(shù)：細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 用等滲稀釋液將細(xì)胞稀釋一定倍數(shù)，充入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池，計(jì)數(shù)一定體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目，經(jīng)換算求出每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)量。 計(jì)數(shù)板為一塊特制的長方形厚

3、玻璃板，在板的中部有4條槽，中間兩槽之間有一條橫槽把計(jì)數(shù)板的中部隔成二個(gè)平臺(tái)，每個(gè)平臺(tái)中間都有一個(gè)計(jì)數(shù)室，此平臺(tái)比整個(gè)玻璃板的平面低0.1mm，當(dāng)放上蓋玻片后，平臺(tái)與蓋玻片之間的高度為0.1mm。在顯微鏡下可看到，計(jì)數(shù)室被劃分為邊長為1mm的9個(gè)大方格，四角的大方格，又分為16個(gè)中方格，適用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)。中間的一個(gè)大方格又被雙線分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又各分成16個(gè)小方格，適用于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，通常取四角的4個(gè)中方格和中間的1個(gè)中方格來計(jì)數(shù)紅細(xì)胞。 原始培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)/ml 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4104稀釋倍數(shù) 細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟：細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟： 1.將血球計(jì)數(shù)板及蓋玻片用蘸95乙醇的棉團(tuán)擦干凈晾干后，將

4、蓋玻片蓋于計(jì)數(shù)池上面。 2.將細(xì)胞培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋并充分混勻，吸取少量（約10L）沿蓋玻片的邊緣充填入計(jì)數(shù)池中，注意勿發(fā)生氣泡或使稀釋液流出計(jì)數(shù)池。 3.靜置一兩分鐘后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)為了避免大的誤差，應(yīng)當(dāng)稀釋適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度；為了防止重復(fù)和遺漏，應(yīng)按一定的順序計(jì)數(shù)；如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)；可以多次計(jì)數(shù)以求平均值。計(jì)數(shù)紅細(xì)胞時(shí)，若各中方格數(shù)目相差20個(gè)以上，需重新計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí)，若細(xì)胞聚集成團(tuán)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算；若成團(tuán)達(dá)10以上，需重新制備懸液；若各個(gè)大格間數(shù)目相差10以上，需要重新計(jì)數(shù)。 4.計(jì)算細(xì)胞數(shù)。 5.用蘸95乙醇的棉團(tuán)擦干凈計(jì)數(shù)板及蓋

5、片。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)步驟： 收集對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞(25cm培養(yǎng)瓶中)，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋為11ml，然后接種于24孔組織培養(yǎng)板中，接種體積為100L/孔。再于每孔中加入900L含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。每組實(shí)驗(yàn)最少設(shè)3個(gè)復(fù)孔。 以10%（100L）、5%（50L）、2.5%（25L）的濃度將二甲亞砜加入種有細(xì)胞的24孔組織培養(yǎng)板中，同時(shí)以不加二甲亞砜處理的Hela細(xì)胞為對照組。 將24孔組織培養(yǎng)板置于37、飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。 吸棄培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)液吸棄培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)液，各加入，各加入100l的的PBS液，輕

6、輕振蕩液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。 吸棄吸棄PBS，各，各加入加入100l0.25胰蛋白酶胰蛋白酶消化液，消化消化液，消化35 min，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙。，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙。 各加入各加入200 l含有血清的含有血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)液，反復(fù)，反復(fù)吹打細(xì)胞吹打細(xì)胞，使其成均勻的細(xì)胞懸液。使其成均勻的細(xì)胞懸液。 各取各取10微升懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（微升懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之未染計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之未染色的細(xì)胞總數(shù)，再除色的細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)，乘以稀釋倍數(shù) 。注：注：4大格細(xì)胞大格細(xì)胞總數(shù)總數(shù)/4稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)104=細(xì)胞