1、第51卷 第24期 2006年12月論 文入侵害蟲蔗扁蛾幼蟲期體內(nèi)蛻皮激素的定性定量分析王方海 張古忍* 溫瑞貞 何國(guó)鋒(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆蟲學(xué)研究所, 廣州 510275. * 聯(lián)系人, E-mail: zhanggr)摘要 利用液相色譜和放射免疫分析法對(duì)入侵害蟲蔗扁蛾Opogona sacchari (Bojer)幼蟲期體內(nèi)的蛻皮激素進(jìn)行了定性和定量分析, 以期明確蔗扁蛾幼蟲期體內(nèi)蛻皮激素的主要組分及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律. 蔗扁蛾幼蟲期體內(nèi)的蛻皮激素種類主要是20-羥基蛻皮激素, 還含有少量的26-羥基蛻皮激素. 若按每頭幼蟲所含的蛻皮激素含量來(lái)計(jì)算, 從1齡到7齡

2、蛻皮激素含量呈遞增的趨勢(shì), 如將各齡幼蟲蛻皮激素含量換算成每克體重所具有的量來(lái)進(jìn)行比較, 則各齡期幼蟲的蛻皮激素含量沒(méi)有明顯的規(guī)律可言. 整個(gè)6齡幼蟲發(fā)育期間僅在第2天出現(xiàn)一個(gè)明顯的蛻皮激素峰值, 含量達(dá)到0.5475 ng/蟲; 而整個(gè)7齡幼蟲發(fā)育期間, 發(fā)現(xiàn)有2個(gè)明顯的蛻皮激素峰值, 分別位于第3和第5天, 含量則分別達(dá)到0.2942和0.2140 ng/蟲.關(guān)鍵詞 蔗扁蛾 蛻皮激素 幼蟲蔗扁蛾Opogona sacchari (Bojer)為鱗翅目Lepid- optera輝蛾科Hieroxestidae扁蛾屬Opogona, 起源于非洲潮濕的熱帶和亞熱帶地區(qū). 目前, 已擴(kuò)散至美洲、歐

3、洲和地中海地區(qū). 我國(guó)于1997年報(bào)道發(fā)現(xiàn)此蟲, 其主要隨香龍血樹(巴西木) Dracaena fragrans和馬拉巴栗(發(fā)財(cái)樹)Pachira macrocarpa等蟲源花木進(jìn)入我國(guó), 首先在廣東、海南等地的花卉場(chǎng)定殖下來(lái), 然后隨花木的調(diào)運(yùn)傳至全國(guó)各地. 該蟲可為害巴西木、發(fā)財(cái)樹、甘蔗、香蕉等花卉及經(jīng)濟(jì)作物, 已記載的寄主植物有29科104種2. 蔗扁蛾完成一個(gè)世代平均需要90.5 d, 在華南全年可發(fā)生4代. 幼蟲是該蟲的為害期, 長(zhǎng)達(dá)3575 d, 分為7齡, 鉆蛀性是其對(duì)寄主植物造成危害的主要方式.近幾年的研究主要集中在蔗扁蛾生物學(xué)和生態(tài)學(xué)方面展開, 特別是對(duì)寄主植物的調(diào)查非常深入

4、4, 而有關(guān)生理生化方面的研究則顯得異常薄弱, 致使對(duì)該蟲的生理規(guī)律的了解嚴(yán)重不足, 急需開展這方面的研究, 以進(jìn)一步增加對(duì)蔗扁蛾生理特性的認(rèn)識(shí), 為今后尋找開發(fā)更有效的防治措施提供理論依據(jù)和指導(dǎo).蛻皮激素是調(diào)控昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育最為重要的激素之一, 為一類多羥基化的甾醇類化合物, 目前在昆蟲中發(fā)現(xiàn)的有-蛻皮激素、20-羥基蛻皮激素、26-羥基蛻皮激素、2-脫氧蛻皮激素等多種組分, 但多數(shù)昆蟲中蛻皮激素的組分主要是-蛻皮激素或20-羥基蛻皮激素5,6. 在昆蟲中, 除了誘導(dǎo)幼蟲蛻皮外, 蛻皮激素對(duì)成蟲生殖、滯育及胚胎發(fā)生等也起到一定的調(diào)節(jié)作3用.因此本研究從生理生化的角度著手, 在探明蔗扁蛾蛹期蛻皮

5、激素的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律后, 進(jìn)一步利用液相色譜和放射免疫分析法對(duì)蔗扁蛾幼蟲體內(nèi)的蛻皮激素進(jìn)行了定性和定量分析, 以期明確蔗扁蛾幼蟲體內(nèi)蛻皮激素的主要組分及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律, 同時(shí)為今后用具有蛻皮激素活性的化合物RH-2485來(lái)防治蔗扁蛾的研究提供一定的參考.1 材料與方法() 蟲源及其飼養(yǎng). 自廣州市芳村區(qū)某花木場(chǎng)被蔗扁蛾為害的發(fā)財(cái)樹中采集高齡幼蟲帶回實(shí)驗(yàn)室, 并以被害的發(fā)財(cái)樹飼養(yǎng), 至第2代時(shí), 開始收集各齡期幼蟲. 昆蟲在溫度28, 16 h(L)/8 h(D)和RH75%條件下飼養(yǎng).() 幼蟲的采集及處理. 在每個(gè)齡期的第3天分別采集5頭幼蟲, 重復(fù)3次. 然后在整個(gè)6齡和7齡期階段(該條件下飼

6、養(yǎng), 6齡幼蟲歷期7 d, 7齡幼蟲歷期8 d), 每天收集幼蟲各5頭, 重復(fù)3次. 每樣品加1 mL甲醇, 用剪刀將收集的幼蟲剪碎并勻漿后儲(chǔ)存在26的冰箱中直至蛻皮激素分析用.() 蛻皮激素的抽提. 具體參考Haegele等人的方法. 將上述樣品在60的水浴鍋中加熱10 min, 并在10000×g下離心10 min. 采集上清, 沉淀物用同樣的方法再抽提2次. 將每樣品的上清混合在一起, 在減壓的條件下蒸干, 在干燥的殘留物中加入70%的甲醇和己烷各300 L進(jìn)行分層以去除非極性脂類物質(zhì)10. 去除帶有脂類物質(zhì)的己烷層, 將下面的甲醇2870 論 文層干燥后, 重新溶于500 m

7、L的70%甲醇待用. () 蛻皮激素的定性分析. 將待測(cè)的樣品蒸干后重新溶入100 L的甲醇中, 注入Merck-Hitachi D-6000型高壓液相色譜儀(附242紫外檢測(cè)儀). 使用LiChrosphere 100RP-18反相柱(15 cm × 4 mm i.d., 4 m, Merck, Darmstadt, Germany), 以15%乙腈/0.1%三氟乙酸水溶液進(jìn)行洗脫, 流速1 mL/min. 以-蛻皮激素、20-羥基蛻皮激素、26-羥基蛻皮激素、2-脫氧蛻皮激素和makisterone A (MaA) 作為標(biāo)準(zhǔn)樣品, 因?yàn)檫@幾種蛻皮激素在昆蟲中是已發(fā)現(xiàn)的主要種類.(

8、) 蛻皮激素的定量分析. 采用放射免疫分析法測(cè)定蛻皮激素的含量, 具體方法參照文獻(xiàn)11, 23, 24-3H蛻皮激素(New England Nuclear Research Products, Boston, MA)作為標(biāo)志的配體, 20-羥基蛻皮激素為標(biāo)準(zhǔn)樣品. 抗血清由匈牙利Szeged大學(xué)Maróy博士制備, 使用時(shí)稀釋8000倍, 與-蛻皮激素、20-羥基蛻皮激素、26-羥基蛻皮激素、2-脫氧蛻皮激素均具有較好的親和力. 樣品中蛻皮激素的含量以20-羥基蛻皮激素的當(dāng)量表示.2 結(jié)果2.1 蛻皮激素的定性將從不同齡期的幼蟲中抽提出的蛻皮激素用高壓液相色譜分析, 發(fā)現(xiàn)均有一個(gè)明

9、顯的峰和一個(gè)次峰, 圖1只列出了7齡幼蟲體內(nèi)蛻皮激素的色譜圖. 主峰與20-羥基蛻皮激素的標(biāo)樣有相同的保留時(shí)間, 為8.4 min; 次峰與26-羥基蛻皮激素的標(biāo)樣有相同的保留時(shí)間, 且用放射免疫分析法發(fā)現(xiàn)所收集的這2個(gè)峰的餾分具有明顯的蛻皮激素免疫活性, 這些結(jié)果說(shuō)明蔗扁蛾幼蟲期體內(nèi)的蛻皮激素種類主要是20-羥基蛻皮激素和26-羥基蛻皮激素.圖1 7齡幼蟲期體內(nèi)蛻皮激素的高壓液相色譜分析 第51卷 第24期 2006年12月2.2 幼蟲期蛻皮激素的動(dòng)態(tài)變化不同齡期的蛻皮激素含量測(cè)定結(jié)果如圖2所示, 按每頭幼蟲所含的蛻皮激素含量來(lái)計(jì)算, 1齡幼蟲的蛻皮激素含量?jī)H為0.0003 ng/幼蟲, 而

10、7齡幼蟲高達(dá)0.3467 ng/幼蟲, 從1齡到7齡蛻皮激素含量呈遞增的趨勢(shì). 考慮到不同齡期的幼蟲個(gè)體差異極大, 如1齡幼蟲的體重平均為0.14 mg, 而7齡幼蟲的體重平均為194.89 mg, 兩者相差1000多倍, 因此將各齡幼蟲蛻皮激素含量換算成每克體重所具有的量來(lái)進(jìn)行比較, 則結(jié)果見(jiàn)圖3, 1齡幼蟲平均每克體重含2.3786 ng的蛻皮激素, 高于7齡幼蟲平均每克體重所含的1.7787 ng的蛻皮激素, 整體上來(lái)看, 按每克體重所具有的量來(lái)進(jìn)行比較, 各齡期幼蟲的蛻皮激素含量沒(méi)有明顯的規(guī)律可言.圖2 幼蟲期蛻皮激素的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差, 樣本均為各齡幼蟲期第3天

11、幼蟲圖3 幼蟲期蛻皮激素的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差, 樣本均為各齡幼蟲期第3天幼蟲2871第51卷 第24期 2006年12月2.3 6齡幼蟲期蛻皮激素的動(dòng)態(tài)變化我們測(cè)定了整個(gè)6齡幼蟲發(fā)育期間的蛻皮激素含量, 發(fā)現(xiàn)第2天的6齡幼蟲有一個(gè)明顯的峰值, 蛻皮激素含量達(dá)到0.5475 ng/蟲, 而其他時(shí)間里6齡幼蟲的蛻皮激素含量均處在較低的水平, 都不超過(guò)0.0300 ng/蟲(圖4).圖4 6齡蟲蛻皮激素動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差2.4 7齡幼蟲期蛻皮激素的動(dòng)態(tài)變化我們同時(shí)也測(cè)定了整個(gè)7齡幼蟲發(fā)育期間的蛻皮激素含量, 發(fā)現(xiàn)有2個(gè)明顯的峰值,分別位于第3天和第5天, 蛻皮

12、激素含量則分別達(dá)到0.2942和0.2140 ng/蟲, 而其他時(shí)間里蛻皮激素含量相對(duì)較低, 都不超過(guò)0.1000 ng/蟲(圖5).圖 5 7齡蟲蛻皮激素的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差3 討論對(duì)于昆蟲幼蟲體內(nèi)蛻皮激素的鑒定研究已有很多報(bào)道, 多數(shù)研究表明, 幼蟲期的蛻皮激素組分主要以-蛻皮激素和20-羥基蛻皮激素為主. 此外, 還有26-羥基蛻皮激素、2-脫氧蛻皮激素和20, 26-羥基蛻皮激素等多種組分13,14. 而在本研究中, 蔗扁蛾幼蟲期體內(nèi)的蛻皮激素種類也是以20-羥基蛻皮激素為2872 論 文主, 但還含有少量的26-羥基蛻皮激素. 另外, 我們注意到, 蔗扁蛾幼蟲期和

13、蛹期的蛻皮激素均以20-羥基蛻皮激素為主要組分, 但蛹期中未檢測(cè)到26-羥基蛻皮激素.多數(shù)昆蟲在末齡幼蟲期都有兩個(gè)蛻皮激素峰出現(xiàn). 第一個(gè)峰為非蛻皮峰, 可能與誘發(fā)幼蟲的變態(tài)有關(guān); 第二個(gè)峰為蛻皮峰, 與幼蟲的預(yù)蛹發(fā)育和蛻皮有關(guān)15. 對(duì)蔗扁蛾的測(cè)定結(jié)果表明, 其末齡幼蟲中蛻皮激素含量的動(dòng)態(tài)變化與其他昆蟲的一般模式相一致, 即整個(gè)末齡期有兩個(gè)分離的蛻皮激素峰存在(圖5).同時(shí)我們還測(cè)定了6齡(倒數(shù)第2齡)蔗扁蛾的蛻皮激素含量的動(dòng)態(tài)變化, 發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)蛻皮激素峰存在, 與末齡期的模式相比, 少了一個(gè)峰. 在其他昆蟲的研究中, 如沙漠蝗、家蠶, 發(fā)現(xiàn)倒數(shù)第2齡幼蟲中也均只有一個(gè)主要的峰存在.此外,

14、 由于RH-2485是一種具有蛻皮激素活性的新型化合物, 主要用來(lái)防治幼蟲期的鱗翅目害蟲18, 而目前尚未有應(yīng)用RH-2485來(lái)防治蔗扁蛾的研究報(bào)道, 因此本研究首次闡明了蔗扁蛾幼蟲期蛻皮激素的主要組分和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律, 不僅從生理水平上進(jìn)一步增加對(duì)蔗扁蛾本性的認(rèn)識(shí), 同時(shí)為今后使用RH-2485來(lái)防治蔗扁蛾的研究提供了有關(guān)蟲體內(nèi)自身蛻皮激素動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的背景知識(shí), 具有一定的參考和指導(dǎo)價(jià)值.致謝 感謝捷克共和國(guó)科學(xué)院昆蟲研究所Sehnal教授提供技術(shù)幫助. 本工作為國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 39870476)、廣東省自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): E039254, 031626)和珠海市科技計(jì)劃(批

15、準(zhǔn)號(hào): PC20051046)資助項(xiàng)目.參 考 文 獻(xiàn)1 程桂芳, 楊集昆. 北京發(fā)現(xiàn)的檢疫性新害蟲蔗扁蛾初報(bào). 植物檢疫, 1997, 11(2): 951052 張古忍, 古德祥, 劉秀玲, 等. 新侵入害蟲蔗扁蛾的寄主范圍正在擴(kuò)大. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2000, 27(3): 2832843 溫瑞貞, 張古忍, 何國(guó)鋒, 等. 新侵入害蟲蔗扁蛾的生活史研究.昆蟲學(xué)報(bào), 2002, 45(4): 5565584 張古忍, 古德祥, 蔗扁蛾. 見(jiàn): 萬(wàn)方浩, 鄭小波, 郭建英, 主編.重要農(nóng)林外來(lái)入侵物種的生物學(xué)與控制. 北京: 科學(xué)出版社, 2005. 3483595 Tawfik A I,

16、 Vedrova A, Sehnal F. Ecdysteroids during ovarian de-velopment and embryogenesis in solitary and Gregarious Schisto-cerca Gregaria. Arch Insect Biochem Physiol, 1999, 41: 1341436 曹梅訊, 蔣容靜. 蛻皮甾體的結(jié)構(gòu)與功能及其應(yīng)用研究進(jìn)展. 見(jiàn):論 文周維善, 莊治平, 編. 甾體化學(xué)進(jìn)展. 北京: 科學(xué)出版社, 2002 7 王方海, 龔和. 滯育和非滯育棉鈴蟲血淋巴中類固醇蛻皮素含量變化的比較. 昆蟲學(xué)報(bào), 1997

17、, 40(3): 2612648 Haegele B F, Wang F. Effects of crowding, isolation, and transfer fromisolation to crowding on total ecdysteroid content of eggs in Schisto-cerca gregaria. J Insect Physiol, 2004, 50(7): 621628 9 王方海, 張古忍, 溫瑞貞, 等. 新入侵害蟲蔗扁蛾蛹期蛻皮激素的定性定量分析. 科學(xué)通報(bào), 2006, 51(8): 91992210 Dinan L N, Rees H

18、H. The identification and titres of conjugatedand free ecdysteroids in developing ovaries and newly laid eggs of Schistocerca gregaria. J Insect Physiol, 1981, 27: 5158 11 Chang E S, OConnor J D. Arthropod molting hormones. In: JaffeB M, Behrman H R, eds. Methods of Hormone Radioimmunoassay. New Yor

19、k: Academic Press, 1979. 79781412 Smith S, Fukaya M. Regulation of ecdysteroid titer: Systhesis. In:Kerkut G A, Gilbert L I, eds. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Oxford: Pergaman Press. 1985, 7: 295342 第51卷 第24期 2006年12月13 宋齊生, 孫小平. 昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的激素調(diào)控及信號(hào)傳遞. 見(jiàn): 劉同先, 康樂(lè), 主編, 昆蟲學(xué)研究進(jìn)展與展望. 北京: 科學(xué)出版社, 2005. 8912314 邱明華. 昆蟲蛻皮物質(zhì), 在生命活動(dòng)中扮演什么角色. 自然雜志,2005, 27(3): 16116515 王滿囷, 李周直. 鞭角華扁葉蜂蛻皮甾類激素滴度的變