1、烏頭簡單序列重復區間擴增條件的優化<                          作者：張岳峰 萬里翔 侯大斌【摘要】   目的保證烏頭ISSR-PCR的穩定性、提高對烏頭遺傳多樣性,親緣關系分析、種質鑒定的可靠性。方法收集西南地區23個烏頭材料，以Mg2+，dNTP，引物和聚合酶建立L9（34）正交設計，并同時考察模板和甲酰

2、胺濃度及退火溫度，建立適宜的ISSR-PCR體系。結果以Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.3 mol/L、rTaq酶1U、模板1.5 ng/l、甲酰胺2%及退火溫度（Tm-3）的ISSR反應體系最優。結論實驗建立的ISSR-PCR體系反應穩定，能用于烏頭的ISSR分析。 【關鍵詞】   烏頭 簡單序列重復區間 優化Abstract：ObjectiveTo keep the stability of ISSR_PCR and reliability of genetic diversity, sibship analysis and source

3、assessing for Aconitum carmichael Dexb. Methods23 kinds Aconitum carmichael Dexb. samples in southwest of China were selected to carry out 4 factors(Mg2+，dNTP，primer and Taq polymerase) and 3 levels(concentration) orthogonal design experiment. Meanwhile separated experiments for forma-mide, template

4、 concentration and annealing temperature affect were carried out.ResultsISSR_PCR reaction system could be well established through orthogonal design experiment by 23 samples ISSR-PCR reaction assessing.ConclusionThe optimized ISSR-PCR reaction system can be stably used for Aconitum carmichael Dexb.

5、genetic analysis.Key words：Aconitum carmichael Dexb.;   Inter-Simple Sequence Repeat;   Optimization    烏頭Aconitum carmichael Dexb為毛茛科烏頭屬植物，別名五毒根1。為毛茛科植物烏頭，在 中國 西南地區四川盆地有較大栽培面積，其母根叫烏頭或川烏，為鎮痙劑，可用于治風痹、風濕神經痛。側根（子根）入藥，稱附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)。  

6、 ISSR-PCR技術，簡單序列重復區間(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)，是Zietkiewicz等21994年創建的，引物是根據基因組內某一重復序列設計出一系列特異性引物，包括雙核苷酸、三核苷酸和四核苷酸等微衛星片段。這種技術除具有RAPD優點外，比RAPD技術更具有明確的針對性，同時由于PCR擴增條件中的退火溫度較高(50左右)，保證了PCR擴增的可重復性，結合了SSR和RAPD的優點。可以快速、高效和靈敏地檢測出基因組DNA的多態性, 有很好的重復性, 操作簡單、成本較低, 適合大樣本的檢測3。關于野生烏頭的RAPD的優化與遺傳分析已有報道4，川烏I

7、SSR遺傳分析也有報道5。因此建立穩定好、重復性強的ISSR反應體系對烏頭遺傳學、種質資源、分類學與種系發生學等方面具有重要意義。 1  材料    從四川綿陽安縣曉壩（海拔850 m）已建立的附子資源圃200份附子種質資源類型中篩選出優勢代表材料23份（見表1），上年種植，200707采摘頂部功能嫩葉數片，置4保存，提取DNA所用。表1  烏頭樣品引種來源（略） 2  方法 2.1  DNA提取采用陳亮6并稍加改良的CTAB方法提取DNA，通過紫外和瓊脂糖電泳檢測其純度、濃度和完整性后，用以ISSR-PCR優化實驗。2.2

8、  反應體系正交實驗 采用L9(34)正交實驗設計，對Mg2+（大連TaKaRa提供），dNTP（TaKaRa），引物（上海生工提供）和rTaq聚合酶（TaKaRa）進行4因素3水平7篩選，方案如表2。根據表2制備總體積為20 l的反應體系，體系中還存在1×PCR緩沖液和30 ng模板DNA，其余用過柱超純水補充，引物選用哥倫比亞UBC系列847號引物，在德國Eppendorf Mastercycler Gradient儀上擴增，PCR擴增程序為：94預變性3 min，94變性30 s，Tm8473(52.8-3=49.8)退火45 s，72延伸2 min，40個循環；72

9、延伸10 min，4保存。    擴增結束后，PCR產物在1.5%的含溴化乙錠(0.5 g/ml)瓊脂糖凝膠電泳，電極緩沖液為0.5×TBE,電壓3V/cm,電泳結束在Bio-Rad凝膠成像系統分析并拍照。2.3   模板DNA濃度篩選   應用 表2中最佳組合，選用引物UBC846，20 l體系中模板濃度分別置為0.5，1.5，3.0 ng/l和6 ng/l共4個濃度處理。2.4  甲酰胺對擴增穩定性實驗選定的正交最佳反應體系,選用引物UBC846，20 l體系中設空白對照；甲酰胺(綿陽榮盛AR)濃度分

10、別為0.5%，1.0%，2.0%和4.0%。表2  ISSR-PCR正交實驗設計（略）2.5  不同復性溫度影響   根據正交最佳體系，結合引物UBC846用梯度PCR儀設定PCR退火溫度梯度范圍4555。 3  結果 3.1  PCR正交實驗分析PCR擴增結果是由Mg2+，dNTP引物和DNA聚合酶綜合交互共同決定的，從圖1中可以看出，各種因素的濃度差異，擴增結果有顯著的差別。其中8，7，9號譜帶依次增強，其原因是由于rTaq酶的增加。2，4，8酶量相同，PCR產物隨Mg2+和dNTP的濃度的增加而增加，當濃度過高時候就會產生條帶亮

11、度增大，出現模糊的邊緣，甚至產生背景使條帶的混連。3號譜帶較弱可能是因為Mg2+濃度過低而dNTP濃度偏高，由于dNTP能夠和Mg2+結合使得游離Mg2+進一步減少，影響了rTaq的活性。5，7，9號譜帶彌散是因為Mg2+濃度過高而引起。在dNTP濃度相同時，過量的酶或Mg2+會造成嚴重的背景干擾和非特性產物的擴增。第6泳道非常清晰，背景很小。通過比較以特異譜帶多態性高、背景干擾低、主帶清晰、副帶明顯為原則，同時考慮實驗成本，即采用Mg2+2.0 mmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，引物0.3 mol/L，rTaq聚合酶1 U的最佳20 l反應體系。圖1  正交設計ISS

12、R_PCR反應結果（略）3.2   模板濃度的確定   由圖2可以見，當20 l反應體系中，模板量從0.56 ng/l均有擴增，但到了濃度達到6 ng/l條帶變得異常模糊，1.5 ng/l濃度的模板擴增效果很清楚，因此反應體系中模板濃度確定為1.5 ng/l。圖2  不同模板濃度對擴增影響（略）3.3  甲酰胺濃度的確定在篩選引物的時候，發現有些引物尤其是Tm較低的非錨定引物，擴增時有非特異拖帶，其原因是引物在模板上滑動的結果。因此在體系中加入甲酰胺，結果如圖3，表明0.5%濃度過低，幾乎無效果，其它濃度均有一定的效果，其中以2%降低背景效果最明顯。圖3  不同甲酰胺濃度對擴增影響（略）3.4  退火溫度的確定梯度退火結果(圖4)顯示,