1、精品文檔基因表達檢測的最終技術目標是能確定所關注的任何組織、細胞的 RNA 的絕對表達量。可以先從樣本中抽提RNA ，再標記 RNA ，然后將這些標記物作探針與芯片雜交，就可得出原始樣本中不同RNA 的量。然而用于雜交的某個特定基因的RNA 的量與在一個相應雜交反應中的信號強度之間的關系十分復雜，它取決于多種因素，包括標記方法、雜交條件、目的基因的特征和序列。所以芯片的方法最好用于檢驗兩個或多個樣本中的某種RNA 的相對表達量。 樣本之間某個基因表達的差異性（包括表達的時間、空間特性及受干擾時的改變）是基因表達最重要的，而了解RNA的絕對表達豐度只為進一步的應用或多或少地起一些作用。基因表達的

2、檢測有幾種方法。 經典的方法 （仍然重要） 是根據在細胞或生物體中所觀察到的生物化學或表型的變化來決定某一特定基因是否表達。 隨著大分子分離技術的進步使得特異的基因產物或蛋白分子的識別和分離成為可能。隨著重組DNA 技術的運用，現在有可能檢測 分析任何基因的轉錄產物。目前有好幾種方法廣泛應用于于研究特定RNA 分子。這些方法包括原位雜交 NORTHERN 凝膠分析打點或印跡打點 S1 核酸酶分析和 RNA 酶保護研究。這里描述 RT-PCR 從 RNA 水平上檢查基因表達的應用。 8 f3 f- |2 L) K) b7 - - |RT-PCR 檢測基因表達的問題討論.精品文檔關于 RT-PCR

3、 技術方法的描述參見 PCR 技術應用進展，在此主要討論它在應用中的問題。 理論上 1L細胞質總 RNA 對稀有 mRNA 擴增是足夠了 （每個細胞有 1 個或幾個拷貝） 。1L差不多相當于 50100，000 個典型哺乳動物細胞的細胞質中所含RNA的數量，靶分子的數量通常大于50， 000，因此擴增是很容易的。該方法所能檢測的最低靶分子的數量可能與通常的DNAPCR相同；例如它能檢測出單個RNA 分子。當已知量的轉錄 RNA （用 T7RNA聚合酶體外合成）經一系列稀釋，實驗結果表明通過PCR 的方法可檢測出10 個分子或低于10 個分子，這是反映其靈敏度的一個實例。用此技術現已從不到1 個

4、philadelphia染色體陽性細胞株K562 中檢測到了白血病特異的MRNA 的轉錄子。因此沒必要分離polyA+RNA ，RNA/PCR 法有足夠的靈敏度來滿足絕大多數實驗條件的需要。7 H+ F& _* S6 W( a8 p: , - d, 將 PCR 緩沖液同時用于反轉錄酶反應和PCR 反應，可簡化實驗步驟。我們發現整個反應過程皆用PCR 緩沖液的結果相當于或優于先用反轉錄緩沖液合成CDNA ，然后 PCR 緩沖液進行 PCR 擴增循環。當然，值得注意的是 PCR 緩沖液并不最適合第一條 DNA 鏈的合成。我們對不同的緩沖液用于大片段 DNA 合成是否成功還沒有進行過嚴格的研

5、究。反轉錄酶的選擇似乎對實驗方法成功與否并不十分重要。.精品文檔BRL 和 BOEHRINGERMANNHEIM的 MULV 反轉錄酶進行全面的研究，但沒有理由認為來源可靠的反轉錄酶不能適用于該方法。在研究中，我們僅使用了PERKINELMER/CETUS公司生產的 TAQ 聚合酶。cDNA 第一條鏈的合成可用不規則六聚體、寡聚 (dT) 或 PCR下游引物來啟動反應。如果用寡聚(dT) ，一般每次反應加0.1 L就夠了。如果用下游寡核苷酸作為第一條鏈的起始引物，10-50pmol 最為理想。反轉錄反應以后，加入適量的上游和下游引物進行 PCR 反應與用不規則六聚體方法一樣。三種啟動方法中無論

6、用那一種最后得到的擴增產物都同樣理想。而加入不規則六聚體似乎更容易得到前后一致的結果，且靶序列的合成量通常最多加入不規則六聚體方法一樣。三種啟動方法中無論用那一種最后得到的擴增產物都同樣理想。而加入不規則六聚體似站更容易得到事一致的結果，且靶序列的合成量通常最多未發表 )。第一條鏈合成完畢， 不必加堿或RNA 酶以除去RNA 模板。 95熱處理使反轉錄酶失活，同時也使RNA-DNA雜合子變性。不必加堿或RNA 酶以除去RNA 模板。 95熱處理使反轉錄酶失活，同時也使RNA-DNA雜合子變性。殘留的RNA 模板似乎對PCR 反應無干擾。5 d' b" L& Q'

7、; y尋找使 PCR 反應產生良好擴增結果的最低濃度的寡核苷酸.精品文檔引物是十分重要的。 我們發現過量的引物通常會產生許多妨礙隨后分析的額外擴增產物。濃度為5pmol 的引物可得到非常清晰及有效的擴增產物。 當然，最好是找到你要擴增的每個序列的最佳引物量。沒有必要用全部的cDNA 反應產物進行PCR 擴增。可取等分量cDNA 樣品用幾組不同的引物作PCR 分析 ;例如 :一份 cDNA 反應物可用于研究幾種不同類型的RNA 。 cDNA 反應物通常用 PCR 緩沖液衡釋 5 倍。將 cDNA 的濃度隆低至 0.2mM ，此濃度更適于 Taq 聚合酶。 dNTP 濃度不應超過 0.2mM ，因

8、為較高濃度的 dDTP 使 Taq 聚合酶的錯誤摻入或突變率增高。對于擴增來說，即使 dNTP 的濃度低到 0.05mM 也不會出現問題。' R7 z) H' u1 ( 鎂離子濃度對反應十分重要，因此應注意將鎂的摩爾濃度保持恒定。有時核酸溶于含1mMEDTA的緩沖液中， EDTA 可殲螯合大多數鎂離子。通常，PCR 反應中游離鎂離子濃度應保持在 2mM 。將 PCRA 循環次數減少，不可避免地產生許多非特異性的擴增產物。很容易將長度不同的 DNA 的擴增。即使基因組序列得到擴增， 當引物與大小不同的外顯子結合時， 很容易將長度不同的 MRNA 與基因組的產物區別一來。如果不了解

9、基因組的結構，選用與 5" 編碼基因間隔 300-400bp 的引物，脊椎動物的外顯子很少大于 300-400bp，因此很容易從不同的外顯子中導出引.精品文檔物。如果所研究的基因無內含子、或者研究完整原病毒RNA 轉錄，為了獲得有關PCR 的結果有必要用DNA 酶徹底處理RNA 。只要有很少量的基因組DNA 污染，用此方法分析就會出現假陽性結果。 9 9 o- ( v; U N# % r$ h9 |- L1 i7 ( _+ - h實際應用舉例/ W" 1 T. m$ P0 F$ M+ x基因表達檢測8 p. z L9 A' G7 J" Q c8 q7 X用

10、該方法先后擴增， 檢測了許多不同類型的細胞、組織和器官的 mRNA 。當然，僅僅檢測 mRNA 并沒有新穎之處，它的新穎在于能對 10-1000 個細胞的 RNA 進行分析。所需起始物質比通常的低很多，這使得研究者能設計并進行以前看是不可能進行的實驗。例如研究血細胞生成的研究人員經常用群體分析確定生長因子或環境對特殊細胞系發育的影響。經常部到的一個問題是:群體細胞產生的何種生長/分化因子會影響其本身的發育。現在可以確信，利用 RNA/PCR 技術能夠對數百個群體的 mRNA 對任何與生長或分化有關的因子進行分析。 而用常規的雜交或抗體檢測方法來分析它們是極其因難、甚至是不可能的。 RNA/PC

11、R 技術在研究轉基因動物方面將非常有用。 我們常常不僅要知道在動物體內轉移的基因是否表達， 而且要知道是在哪些細胞 組織或器官中表達。 隨著 RNA/PCR 檢測靈敏度的提高， 能夠檢測轉.精品文檔基因動物的多個部位而不必為取樣而將它處死。我們還可以列舉許多這樣的例子，但我們留給讀者一些有關檢測方面的設想。4 $ i k2 N2 N, s( q用于診斷的 RNA 序列的擴增 ' n. u6 Y& ! m: g( |/ Z " j# i' V7 _. l" f. h, e. M在許多情況下，一個特異性的RNA 分子可作為感染或遺傳/癌疾病的診斷。在反轉

12、錄病毒疾病領域中，檢測與具有侵染活性密切相關的反轉錄病毒RNA 基因組或特異轉錄子是否存在是非常重要的。現已對 HIV-1 病人，HTLV-1 ，2 以及 MoloneyMulV的細胞株進行了研究。 也可以用 RNA/PCR 比較容易地檢測出常見的感冒病毒即人鼻病毒。對 RNA 和 DNA 病毒的 RNA 轉錄子的分析有利于對病毒的潛伏期，復制期等生活周期進行研究。)T0 % v7 C5 O7 z' _! ?- l$ W) p9 + p5 w) 在某些類型的癌細胞中有新的mRNA 表達。如慢性骨髓性白血病 (CML) 某些急性淋巴白血病(ALL) 和急性骨髓白血病(AML) ，只在病人

13、的白細胞中發現有嵌合的mRNA(BCR-ABL)。此嵌合 mRNA 是診斷此類疾病存在的良好依據。在許多腫瘤的治療過程中，腫瘤細胞對化學治療具有抗性。DNA 水平的擴增并不一定導致表達的增加，但大量相應的mRNA 的存在則使表達增加。 DNA 水平的擴增并不一定導致表達的增加，但大量相應的 cDNA 的存在則使表達增加。用RNA/PCR方法來分析復.精品文檔合抗藥性 (MDR)10基因和胸腺核苷酸合成酶(TS) 基因，發現了這 mRAN 水平的增高 .突變的 RAS 原癌基因的 mRNA 分析 (見參考文獻 25 綜術述 ) 在癌癥的診斷或預測方面具有診斷價值。mRNA 分析比常規的DNA 基

14、因組分析有優越之處。 由于沒有內含子序列干擾mRNA 的擴增，因此可以僅用一組引物就能夠擴增 H- ，K- ，和 N-RAS 三個 mRNA 序列，未發表 )。這樣便可以比較容易地檢測出第 12、13 和 61 密碼的突變， 這些突變被認為是發生癌的原因。癌癥誘因的檢測3 j. s) S/ ' v' f; g在下面將列舉數個 RNA/PCR 擴增方法的主要應用。 首先是對鼠鳥氨酸氨甲棧基轉移酶 mRNA 進行亞克隆來確定缺失點突變的位置。同樣，該方法可用于檢測哺乳動物細胞mRNA 轉錄后的剪接，研究與HLA 疾病相關性因素，分析人HPRT 突變，研究自身免疫與T 細胞受體序列之

15、間的關系，分析人堿性磷酸脂酶的突變， 研究土撥鼠肝炎病毒引發的c-myc 活性，確定刺桐丁蛋白 4.1mRNA 的剪接變異，等等。 6 p/ l$ I6 5 W' E5 ; U9 a$ 根據已發表的序列合成擴增mRNA的引物，我們發現用RNA/PCR是獲取 cDNA 的最簡便的方法。用在5" 末端帶有限.精品文檔制性內切酶位點的引物來擴增 mRNA 的一部分或全部編碼區域。擴增后， PCR 產物經合適的酶切并與適于表達的載體連接或制備成探針。按此方法可在一星期內完成從RNA 樣品到用于高效表達的修飾 cDNA 克隆 .這比常規的合成 /篩選 cDNA 庫，亞克隆靶 cDNA ，為達到表達目的而對克隆進行誘變等過程要簡單得多。