1、補腎化瘀祛痰方對雄激素致不孕大鼠卵巢局部調控因子的影響    中國 【摘要】 目的：觀察補腎化瘀祛痰方（Bushen Huayu Qutan Recipe, BHQR）對雄激素致不孕大鼠（androgen?sterilized rat, ASR）卵巢局部調控因子的影響。方法：選擇9日齡幼年SD雌性大鼠105只，隨機分為病理模型組（90只）和溶媒對照組（15只），丙酸睪丸酮誘導形成ASR。造模成功的30只大鼠隨機分為中藥干預組和模型對照組。中藥干預組用BHQR灌胃干預，模型對照組及溶媒對照組給予蒸餾水灌胃處理，療程30 d。療程結束后觀察大鼠性周期情況，用

2、放射免疫方法檢測血睪酮和胰島素（insulin, INS）含量，用免疫組織化學方法檢測卵巢組織抑制素（inhibin, INH）、胰島素樣生長因子?(insulin?like growth factor?, IGF?)和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表達。結果：BHQR不僅能明顯降低大鼠血INS水平（P<0.05），還能顯著降低INH、IGF?和VEGF在卵巢局部的表達（P<0.01）。大鼠排卵恢復率為66.67。結論：BHQR可能通過改善胰島素抵擋，降低INH、IGF?及VEGF水平，改善卵巢內部環境，多途徑

3、、多靶點促使卵巢功能恢復，促進卵泡生長發育，誘發排卵。 【關鍵詞】 補腎化瘀祛痰方; 不育; 抑制素類; 胰島素樣生長因子; 血管內皮生長因子類; 大鼠Objective: To explore the effects of Bushen Huayu Qutan Recipe (BHQR), a compound traditional Chinese herbal medicine, on local ovarian factors in androgen?sterilized rats (ASR).Methods: One hundred and five 9?day?old SD rat

4、s were randomly divided into normal control group (15 rats) and ASR group (90 rats). ASR was induced by subcutaneous injection of testosterone propionate, and the rat model of ASR was established successfully in 30 rats in the ASR group. Thirty ASR rats were randomly divided into untreated group and

5、 BHQR?treated group. There were 15 rats in each group. The rats in BHQR?treated group were intragastrically administered with BHQR. The rats in the normal control and untreated groups were intragastrically administered with distilled water. They were all treated for 30 days. The levels of serum test

6、osterone and insulin (INS) were measured by radioimmunoassay. The inhibin (INH) level, and the expressions of insulin?like growth factor?(IGF?) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in ovary were determined by immunohistochemical method.Results: None of the ASR ovulated and all the rats in t

7、he normal control group ovulated. The rate of ovulation in BHQR?treated group was 66.67%. The serum concentrations of testosterone and INS in the untreated group were significantly higher than those in the normal control group (P<0.05), and the serum concentrations of testosterone and INS in BHQR

8、?treated group were decreased as compared with the untreated group (P<0.05). The levels of ovarian INH, IGF?and VEGF in the untreated group were significantly higher than those in the normal control group (P<0.01), and the levels of ovarian INH, IGF?and VEGF in BHQR?treated group were decrease

9、d as compared with the untreated group (P<0.01).Conclusion: BHQR is an effective recipe in promoting ovulation, and the effects of BHQR on balancing the internal environment of ovary may be due to the reduction of serum INS level and decrease in the expressions of ovarian INH, IGF?and VEGF.Keywor

10、ds: Bushen Huayu Qutan Recipe; infertility; inhibins; insulin?like growth factor; vascular endothelial growth factors; rats 多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome, PCOS），又稱StEin?Leventhal綜合征，是一種發病多因性、臨床表現多態性疾病，以長期無排卵和持續高雄激素為主要特征1。目前關于PCOS的發病機制學說眾多，但確切病因仍不明確，且缺乏理想的 治療 方法。西醫主要有手術和藥物等治療方法，但由于手術創傷較大，而西藥長期服用毒

11、副作用較大，故臨床應用受到肯定的限制。中醫古籍并無PCOS這一病名，根據臨床表現，應歸屬于月經后期、閉經和不孕癥等范疇，目前中醫在治療PCOS方面已顯示肯定優勢。補腎化瘀祛痰方（Bushen Huayu Qutan Recipe, BHQR）是臨床 總結 的治療PCOS的有效方劑2，本研究擬從血睪酮、胰島素（insulin, INS）、卵巢局部調節因子抑制素（inhibin, INH）、胰島素樣生長因子?（insulin?like growth factor?, IGF?）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）著手進一步研究BHQ

12、R對其的影響。 1 材料與方法 1.1 實驗動物32只3月齡雌性成年SD大鼠和8只3月齡雄性成年SD大鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（滬）2003?0003，由第二軍醫大學長海 醫院 動物中心飼養。將32只雌性成年SD大鼠和8只雄性成年SD大鼠，按41合籠，交配后根據陰栓估計分娩日期，常規大鼠顆粒飼料喂養，自由攝食和飲水，分娩8 d后選出雌性幼鼠105只供實驗用，21 d斷乳。25 恒溫（50%濕度），清潔級飼養，不加飼維生素類制品。12 h光照（6:0018:00）和12 h黑暗（18:006:00）周期交替進行。1.2 藥物與試劑丙酸睪丸酮注射液、中性茶油（上海通用

13、藥業股份有限公司，批號為050503）；BHQR（當歸15 g，赤白芍各10 g，桑椹20 g，枸杞子20 g，瓦楞子15 g，制首烏18 g，麥冬12 g等）由第二軍醫大學長海醫院中藥房提供，自制成濃度相當于含生藥2.56 g/ml的溶液；大鼠胰島素試劑盒（美國LINCO Research公司）；睪酮試劑盒（天津九鼎醫學生物工程有限公司）；兔抗鼠IGF?多克隆抗體（Labvision?NeoMarkers公司）；兔抗鼠抑制素多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗鼠VEGF多克隆抗體（福州邁新生物技術開發公司）。1.3 BHQR水煎濃縮劑的制備取BHQR飲片置煎煮容器內，加相當于藥材量

14、57倍的冷水浸泡30 min，煮沸40 min，過濾。藥渣加35倍量水連續煎煮，煮沸30 min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當于生藥量2.56 g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4 冰箱備用。1.4 動物模型制備按隨機數字表法將105只9日齡雌性幼鼠分為病理模型組和溶媒對照組，其中90只病理模型組幼鼠于分組當日在頸背部皮下一次性注射丙酸睪丸酮注射液0.05 ml（l.25 mg），15只溶媒對照組大鼠于頸背部皮下一次性注射中性茶油0.05 ml。兩組大鼠均于出生21 d后斷乳，70日齡始通過光學顯微鏡觀察陰道脫落細胞涂片，連續觀察10 d，陰道上皮細胞持續角化，無周期性，無排卵，提

15、示雄激素致不孕大鼠（androgen?sterilized rats, ASR）動物模型制備成功。造模成功的大鼠進入后續實驗，不典型的棄去不用。溶媒對照組大鼠70日齡后連續陰道脫落細胞涂片，呈現動情周期者取用。1.5 動物分組及處理30只病理模型大鼠按隨機方法分為中藥干預組和模型對照組，每組15只。80日齡起，按動物與人體表面積比換算法：人用藥劑量（mg/kg）=0.16×大鼠用藥劑量（mg/kg），換算相應劑量，中藥干預組按10 ml/kg體質量灌服BHQR（含生藥2.56 g/ml）；模型對照組及溶媒對照組每天灌胃同容積蒸餾水。每日早、晚各1次，連續30 d。用藥結束后，根據陰道

16、涂片，恢復性周期者，于110日齡后第一個動情前期斷頭處死，無性周期者于113日齡斷頭處死。1.6 觀察動情周期大鼠灌胃20 d后，自99日齡至110日齡，每天作陰道涂片，將涂片行巴氏染色和脫落細胞學檢查（以性周期規則出現為準）。依據大鼠性周期各階段陰道涂片組織學特點，觀察各組大鼠性周期變化情況來判斷大鼠排卵情況。1.7 胰島素釋放實驗及血睪酮檢測晚8時禁食，次晨上午8時按3 g/kg體質量的葡萄糖劑量灌服50%葡萄糖溶液，灌糖0、0.5、1和2 h后眶靜脈取血，將血靜置2 h，離心（2 000 r/min）15 min，分離血清，置于80 冰箱，待測血INS。各工夫點血INS采用放射免疫法檢測

17、，藥盒質量控制指標均符合要求，批內、批間變異系數均<5.5%。大鼠乙醚吸入麻醉，抽取腹主動脈血4 ml左右，將血靜置2 h后，離心（2 000 r/min）15 min，分離血清，置于80 冰箱，待測血睪酮。血睪酮檢測采用放射免疫方法，其操作嚴格按睪酮放射免疫分析藥盒說明書進行。藥盒質量控制指標均符合要求，批內變異系數5.4%7.4%、批間變異系數3.1%6.1%。1.8 卵巢INH、IGF?和VEGF免疫組織化學實驗卵巢組織石蠟切片常規脫蠟至水；經0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液微波抗原修復15 min；加50 l 3% H2O2消退內源性過氧化氫酶，室溫下孵育10 min，PBS洗3 min×3次；加入50 l非免疫性動物血清，室溫下孵育10 min；加50 l兔抗鼠抑制素或50 l兔抗鼠IGF?或50 l兔抗鼠VEGF，用PBS洗3 min×5次；加50 l生物素標記的二抗，室溫下孵