1、陸地棉抗除草劑基因的遺傳轉(zhuǎn)化及其抗鎘脅迫的遺傳效應(yīng)探討陸地棉抗除草劑基因的遺傳轉(zhuǎn)化及其抗鎘脅迫的遺傳效應(yīng)探討棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。棉花遺傳改良可以通過傳統(tǒng)的育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)。現(xiàn)代生物技術(shù)通過DNA重組技術(shù)將外源性狀轉(zhuǎn)入到寄主基因組，可實(shí)驗(yàn)基因在不同生物界之間的自由交換和流動(dòng)，對于增加作物產(chǎn)量、 提高產(chǎn)品質(zhì)量、 減少生產(chǎn)成本和環(huán)境脅迫均具有重要的作用。本研究通過比較二種非基因型限制的外源基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，將抗除草劑基因(Bar 和 Cyp81A6)導(dǎo)入到陸地棉，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并育成抗除草劑的轉(zhuǎn)基因陸地棉種質(zhì)系(BR001)。同時(shí)研究了抗除草劑轉(zhuǎn)基因種質(zhì)系的生產(chǎn)性能、纖維品質(zhì)、 抗

2、性遺傳等， 并以抗蟲轉(zhuǎn)基因抗蟲轉(zhuǎn)基因推廣品種(GK30)和它的遺傳背景親本為對照， 研究了轉(zhuǎn)基因抗除草劑種質(zhì)系 (BR001)在鎘脅迫下的生長發(fā)育和組織生理反應(yīng)。主要結(jié)果如下： 1本研究探討了兩種非基因型依賴性的遺傳轉(zhuǎn)化方法，并研究了Bar 基因在轉(zhuǎn)基因后代的分離和遺傳特點(diǎn)，以及抗除草劑棉花種質(zhì)系(BR001)的生產(chǎn)性能和纖維品質(zhì)。PCR和 Southern 雜交分析表明，外源基因已成功地插入到兩種方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。 盡管項(xiàng)尖農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法的轉(zhuǎn)化效率高于花粉管通道法，但獲得的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)量無明顯差異。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花種質(zhì)系(BR001)的農(nóng)藝性狀略差于親本，但

3、纖維品質(zhì)略優(yōu)于對照。 本試驗(yàn)結(jié)果表明兩種方法均可用于棉花外源基因的轉(zhuǎn)化。2本研究用珂字棉312 和珂字棉 201 胚性愈傷組織為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，將來源于水稻抗苯拉松除草劑基因(Cyp81A6)導(dǎo)入棉花基因組。將以VaMV35啟動(dòng)子、Cyp81A6基因、NP基因構(gòu)建于質(zhì)粒并導(dǎo)入到農(nóng)桿菌菌系LBA444，與胚性愈傷組織共培養(yǎng)48h 后脫菌，接到含 100mg L 卡那霉素和卡那霉素 +苯拉松的篩選培養(yǎng)基上篩選3 次，并在非篩選培養(yǎng)基上繼代23 次后獲得大量的體細(xì)胞胚狀體，并獲得再生小植株。卡那霉素和苯拉松鑒定， 以及 PCR分析結(jié)果均表明， 外源抗草劑基因已成功地導(dǎo)入兩個(gè)基因型的基因組

4、中。目前，轉(zhuǎn)基因植株已移至溫室。3本文研究了不同濃度的鎘對抗除草劑轉(zhuǎn)基因陸地棉種質(zhì)系(BR001)及其抗蟲轉(zhuǎn)基因推廣品種 (GK30)和它的親本 Coker 312 在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上的影響。 結(jié)果表明低濃度 (10 M、100M)的鎘對兩個(gè)轉(zhuǎn)基因栽培品種的發(fā)芽起到了促進(jìn)作用，但是高濃度的鎘 (1000 M)對發(fā)芽起到的是抑制作用。在 Coker312 的發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中，鎘的毒害作用是很強(qiáng)烈的，無論是低濃度的還是高濃度的對 Coker312 的發(fā)芽起到的都是副作用。本文還探討了不同濃度的鎘對兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品種的全植株和根的生理和形態(tài)產(chǎn)生的不同影響。幼苗根鎘的積累率比莖高。在本實(shí)驗(yàn)中 GK30的鎘積累率是最

5、高的，隨后是BR001，最少的是珂字 312。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品種和珂字312 的根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化主要取決于鎘的濃度。隨著鎘濃度的增加它們的根的微細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)隨之發(fā)生變化。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品種表現(xiàn)出了原生質(zhì)體分離，液泡和細(xì)胞核增大的現(xiàn)象。 但是珂字 312 除了液泡增大、線粒體增多外，根尖的亞顯微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。在參試的三個(gè)材料的液泡和細(xì)胞壁上可以看到鎘顆粒的堆積。 這些結(jié)果顯示鎘對棉花幼苗期毒害作用是比較大的。BR001對鎘敏感， GK30和珂字 312 對鎘具有一定的抗性。 4鎘對抗除草劑轉(zhuǎn)基因陸地棉種質(zhì)系 (BR001)及其抗蟲轉(zhuǎn)基因推廣品種(GK30)和它的親本 Coker312 植株在形態(tài)和生

6、理上影響的研究結(jié)果表明，在0，10，100，1000 M鎘濃度下，根、葉片、莖、葉片的厚度和它們的鮮重、干重都呈直線下降趨勢。鎘對根、莖、葉的吸水性有一定的刺激作用，其中對葉片的作用最高，其次是根和莖。在本實(shí)驗(yàn)中鎘在BR001的富集率是最高，其次是GK30珂字 312。根和莖對鎘的吸收是相互關(guān)聯(lián)的，它們的鎘的吸收量影響了根、莖、葉的吸水能力。隨著鎘的濃度的提高葉肉細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，BR001表現(xiàn)最明，顯其次是 GK30和珂字 312。鎘對光合器官也存在一定影響， 在本實(shí)驗(yàn)中葉綠體和線粒體的大小和數(shù)量都發(fā)生了變化。三個(gè)參試材料的液泡和細(xì)胞壁中可以清楚的看到鎘粒子。液泡膜沒有發(fā)生變化。 這表明這些鎘的濃度沒有影響到水分的吸收，還說明了這些材料對鎘有不同的耐性。5本文研究了增加鎘濃度對轉(zhuǎn)基因抗除草劑種質(zhì)系和轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種及其野生型棉花鎘誘導(dǎo)氧化代謝的作用。研究結(jié)果表明， 不同濃度的鎘處理顯著地影響了抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。鎘脅迫對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種和轉(zhuǎn)基因抗除草劑種質(zhì)系及其野生型之間的酶活水