1、.17-雌二醇對胃粘膜細胞系GES-1中ER-蛋白表達的影響張尚昆（江漢大學醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室 湖北 武漢 430056）摘要：觀察不同濃度雌二醇處理不同時間的情況下，人正常胃粘膜細胞系GES-1中ER-蛋白表達量的變化，探討正常胃粘膜細胞中雌激素對ER-蛋白表達可能存在的影響方法：GES-1細胞經(jīng)510-6mol/L、510-8mol/L、10-12mol/L和10-14mol/L的17-雌二醇(17-estradiol，E2)處理24h，應用Western Blot及灰度分析的方法檢測蛋白表達量的改變，平均光密度值采用t檢驗分析。關(guān)鍵詞：雌激素；ER-；正常胃黏膜細胞系胃癌是中

2、國常見惡性腫瘤之一1，其男女發(fā)病率為2：1。Sipponen等發(fā)現(xiàn)女性胃癌發(fā)生時間較男性推遲10-15年，絕經(jīng)期后發(fā)病率與男性相近2。經(jīng)典的雌激素受體（estrogen receptor，ER-，又稱ER-66）在胃癌中表達率遠較乳腺癌低（2%28%），長期以來胃癌被認為是非雌激素依賴性腫瘤。近期研究發(fā)現(xiàn)，選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）與胃癌的發(fā)生有關(guān)2，雌激素在多種傳統(tǒng)意義上的非雌激素依賴腫瘤中發(fā)揮重要作用2，但是，雌激素對正常胃細胞系是否也有影響的研究尚不清楚。ER-36是2005年發(fā)現(xiàn)的獨立存在的ER-66的同源異構(gòu)體。其在乳腺癌中被證明與乳腺癌細胞的生長相

3、關(guān)，尤其是在ER-陰性的乳腺癌中發(fā)揮重要作用，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ER-36對ER-66和ER-具有抑制作用2。ER-36在胃癌中的表達情況和生物學作用未見報道。來自我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，人胃癌組織中存在ER-36分子表達（mRNA和蛋白質(zhì)），并且癌組織中表達量高于癌旁組織及正常組織，胃癌組織及胃癌細胞株中ER-36的表達高于ER-66，胃癌ER-36mRNA表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)3。1 胃癌近年來研究發(fā)現(xiàn)，胃癌與雌激素以及雌激素受體有關(guān)。在胃癌組織中檢測出了雌激素受體的存在。王陸佰等8采用實時熒光定量 RT-PCR 方法檢測了4 株胃癌細胞 AGS、BGC-823 、MKN-45、SGC-7901中E

4、R-36和 ER-66mRNA的表達情況；采用半定量 RT-PCR方法檢測 20例人胃腺癌組織中腫塊、癌旁組織及正常組織中的 ER-36和 ER-66mRNA 表達情況。結(jié)果顯示：ER-36和 ER-66的mRNA 在胃癌細胞株和人體胃癌樣本中均有表達。胃癌細胞株中ER-36表達量高于ER-66；人體樣本中ER-66在正常組織表達量最高，ER-36在癌組織中表達量最高，且與患者的年齡、腫瘤的大小、組織學分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究結(jié)果顯示：ER-36在胃癌細胞中發(fā)揮的作用可能大于ER-66，ER-36mRNA 的高表達與胃癌的生物學行為相關(guān)。2 雌激素受體 ER-的生物學效應初步研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)

5、，ER-36具有細胞因子的作用，在細胞的生長與凋亡中發(fā)揮重要作用。傳統(tǒng)的雌激素受體ER-66為核受體，主要分布在細胞核中，屬于核受體超家族成員，由配體激活存在于核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，行使其生物學效應。通過成骨細胞膜實驗驗證，與經(jīng)典的雌激素受體ER-66不同，ER-36為膜受體9，大量分布于細胞膜的表面，接收來自細胞外和細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導。作為膜受體的ER-36在生理、病理過程中發(fā)揮了與經(jīng)典 ER-66不同的生物學效應。一般情況下，它可以介導細胞信號傳導通路，在細胞的內(nèi)外信息交流中發(fā)揮重要作用。研究顯示，ER-36既可以被雌激素激活，又可以被抗雌激素激活，通過Caveolin-1 介導的 MAPK 信號

6、通路的激活促進乳腺癌細胞增殖10。Caveolin-1 單倍不足可以促進正常乳腺細胞的早期轉(zhuǎn)化11，其機制與 ER-36介導的 PI3 K/AKT 信號通路的激活有關(guān)11；雌激素受體 ER-36參與了子宮內(nèi)膜癌中睪酮誘導的細胞增殖信號通路的調(diào)節(jié)12。此外，雌激素受體ER-36在肝癌和胃癌信號通路調(diào)節(jié)中亦發(fā)揮著重要的生理學作用。由于這種新型的雌激素受體在機體中各個器官的分布以及調(diào)節(jié)作用與傳統(tǒng)的雌激素受體 ER-66具有一定的差異性，因此，值得我們更進一步地研究和探討。3 ER-在胃癌細胞中的表達雌激素(estrogen，E)是一種由內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的類固醇性激素，雌激素與其靶器官乳腺等組織的腫瘤發(fā)

7、生密切相關(guān)3。雌激素通過與雌激素受體(estrogen receptor，ER)的結(jié)合，傳遞細胞生長的信號，對靶器官組織的腫瘤形成產(chǎn)生影響。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素及雌激素介導的信號轉(zhuǎn)導通路在非雌激素依賴的腫瘤如肺癌、膀胱癌及大腸癌等的發(fā)生中具有非常重要的作用4。胃癌中雌激素及雌激素受體作用機制的研究，雖起步較早但一直未取得突破性進展。雌激素及雌激素受體在胃癌發(fā)生與發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移中是否存在并發(fā)揮何種作用，相關(guān)研究仍無定論。早期的研究認為，ER 表達水平與胃癌病人的腫瘤大小、性別、年齡無明顯關(guān)系5。目前研究多認為，ER 陽性的胃癌多為低分化，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及漿膜侵犯，生物學行為不良，預后不佳6

8、。國內(nèi)趙新漢等應用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)ER mRNA較ER蛋白有更高的陽性表達，且多集中于管狀腺癌、低分化腺癌、印戒細胞癌，ER mRNA的表達與胃癌生物學特征密切相關(guān)。Takanoa5等發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中ER-mRNA陽性表達率為51%，ER-mRNA陽性表達率為73%；而在正常胃組織，ER-mRNA陽性表達率為37%，ER-mRNA陽性表達率為88%，且二者的表達變化和胃癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ER-66是最早發(fā)現(xiàn)的雌激素受體-亞型(即傳統(tǒng)觀念的ER-)，已有研究發(fā)現(xiàn)在那些對雌激素敏感的細胞的增殖過程中，ER-66可以起到活化促進生長基因表達的重要作用6。ER-36是王兆一等在2005年克隆并發(fā)現(xiàn)的雌

9、激素受體-的新亞型，分子質(zhì)量為35.7kU，經(jīng)過基因序列的測定、克隆技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)的證實后，將該蛋白質(zhì)命名為ER-366。與ER-66相比，ER-367缺少AF-1和AF-2兩個轉(zhuǎn)錄功能激活域，其主要定位于細胞膜，通過膜雌激素受體介導快速信號轉(zhuǎn)導通路，產(chǎn)生各種生物學效應，并與腫瘤細胞的分化、增殖及凋亡等有密切關(guān)系。4 雌激素的生長調(diào)節(jié)作用當前仍存在爭議。Harrison等報道，雌激素不能調(diào)節(jié)胃癌細胞系的生長，而近期觀點認為，雌激素能促進胃癌生長13。本項研究發(fā)現(xiàn)E2可促進胃癌細胞生長，在10-10，10-11和10-12mol/L時，隨著E2濃度的降低生長速度加快。該現(xiàn)象與絕經(jīng)前期女性（生理

10、狀態(tài)下高雌激素水平）胃癌發(fā)病率較男性胃癌低，絕經(jīng)期后這種差異消失的臨床特點具有一致性2。本研究首先使用無酚紅培養(yǎng)基處理細胞以去除細胞培養(yǎng)過程中酚紅的類雌激素作用，然后，使用1%的活性炭處理的胎牛血清進行胃癌細胞培養(yǎng)，以降低其他生長激素對細胞生長的影響，在此基礎(chǔ)之上，給予不同濃度的E2處理細胞可以準確的反映雌激素對細胞生長的作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素確有促進細胞生長的效應，且與雌激素的濃度有關(guān)。據(jù)此推測，E2可促進胃癌細胞生長。ER-36是2005年發(fā)現(xiàn)的ER-的同源異構(gòu)體2。其蛋白分子質(zhì)量為36 kU，基因結(jié)構(gòu)特征為：缺少轉(zhuǎn)錄激活域AF1和部分AF2，但保留有DNA結(jié)合域、部分二聚化域和部分配

11、體結(jié)合域，啟動子與ER-66完全不同，并具有17個氨基酸長度的特征性序列。ER-36在胃癌細胞中的表達及生物學作用尚無文獻報告14。本項研究在不同E2處理條件下，觀察了ER-36基因和蛋白質(zhì)水平的表達變化。在mRNA水平，給予不同濃度的E2處理，ER-36的表達量均較未處理組增高，并有濃度依賴效應。而在蛋白質(zhì)水平，ER-36的表達變化與mRNA水平并非有完全一致的關(guān)系。表現(xiàn)為ER-36蛋白的表達量與E2濃度呈現(xiàn)依賴效應，但在24h時，ER-36蛋白的表達量高于未處理組，而48h時則均低于未處理組。其結(jié)果顯示，給予雌激素作用后，胃癌細胞的ER-36 mRNA水平呈現(xiàn)持續(xù)的增加（24h 和48h）

12、，而ER-36蛋白質(zhì)的表達量則出現(xiàn)先上升（24h）后下降（48h）的變化趨勢。據(jù)此我們推測，雌激素可能通過調(diào)控位于細胞膜上的ER-36分子，介導了細胞內(nèi)的效應，E2-ER-36途徑在胃癌生長調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用。基于ER-36在乳腺癌和結(jié)直腸癌中的生物學作用和相關(guān)作用機制的研究，我們前期的工作發(fā)現(xiàn)，并結(jié)合上述的實驗結(jié)果提示，ER-36分子可能在雌激素介導的胃癌細胞生長中發(fā)揮比ER-66更為重要的作用15。首先，在無雌激素培養(yǎng)背景和雌激素處理的情況下，E2處理24h時，ER-36在mRNA和蛋白表達水平上隨著雌激素濃度的升高而增高，說明E2對胃癌細胞的促生長作用是通過ER-36實現(xiàn)的，且胃癌細

13、胞中存在轉(zhuǎn)錄水平對ER-36分子的調(diào)控2；其次，在E2處理48h時，雖然ER-36在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達量仍與E2濃度變化一致，但蛋白表達量卻明顯降低，說明隨著雌激素作用時間延長，胃癌細胞可能在翻譯水平對ER-36存在調(diào)控，其具體機制有待進一步證實16。5 結(jié)束語本項研究通過使用不同濃度的17B一雌二醇(17Bestradiol，E2)對人正常胃粘膜細胞株GES-1進行處理，觀察胃黏膜細胞ER-蛋白水平的變化，探討雌激素對胃正常細胞可能存在的調(diào)控作用。參考文獻1 吳春曉，鄭瑩，鮑萍萍，等上海市胃癌發(fā)病流行現(xiàn)況與時間趨勢分析J外科理論與實踐，2008，13：24-292 鄧昊，鎮(zhèn)鴻燕，范軍，

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