1、 Kary Mullis 19933PCRAgarose gel electrophoresisUV 檢測檢測3-4 hours夾心雜交夾心雜交模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低BufferBuffer對樣品不合適對樣品不合適引物設計不當或者發生降引物設計不當或者發生降解解反應條件：反應條件：退火溫度太高，延退火溫度太高，延伸時間太短伸時間太短 原原因因對對策策純化模板或者使用試劑盒提取純化模板或者使用試劑盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量更換更換BufferBuffer或調整濃度或調整濃度重新設計引物（避免鏈間二聚重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級

2、結構）或者換一體和鏈內二級結構）或者換一管新引物管新引物降低退火溫度、延長延伸時間降低退火溫度、延長延伸時間現象：正對照正對照(marker?)(marker?)有條帶，而樣品則無有條帶，而樣品則無； 非特異性擴增 現象：現象：PCRPCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。引物特異性差引物特異性差模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高酶量過多酶量過多MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高退火溫度偏低退火溫度偏低循環次數過多循環次數過多 原原因因對對策策重新設計引

3、物或者使用巢重新設計引物或者使用巢式式PCRPCR適當降低模板或引物濃度適當降低模板或引物濃度適當減少酶量適當減少酶量降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用適當提高退火溫度或使用二階段溫度法二階段溫度法減少循環次數減少循環次數 非特異性擴增 拖尾(與非特異性擴增條帶明顯不同，非特異性擴增帶有明顯的條帶分隔。) 現象：現象：產物在凝膠上呈產物在凝膠上呈Smear狀態狀態。 M 1 2模板不純模板不純BufferBuffer不合適不合適退火溫度偏低退火溫度偏低酶量過多酶量過多dNTPdNTP、MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高循環次數過多循環次數過多 原原因因對對策策純化模板純化模板更換

4、更換BufferBuffer適當提高退火溫度適當提高退火溫度適量用酶適量用酶適當降低適當降低dNTPdNTP和鎂離子的和鎂離子的濃度濃度減少循環次數減少循環次數 拖尾 假陽性（篩選轉基因、檢測基因表達情況（篩選轉基因、檢測基因表達情況) ) 原因：靶序列或擴增產物的交叉污染靶序列或擴增產物的交叉污染打開標本管蓋時樣品飛濺，造成樣品間相互污染。打開標本管蓋時樣品飛濺，造成樣品間相互污染。使用帶有污染的試劑。使用帶有污染的試劑。公用試劑如液體石蠟等污染。公用試劑如液體石蠟等污染。操作時手套引起的交叉污染。操作時手套引起的交叉污染。加樣器通道易形成氣溶膠，氣溶膠常帶有加樣器通道易形成氣溶膠，氣溶膠常

5、帶有PCRPCR產物污產物污染，可用有濾篩的吸頭避免此類污染。染，可用有濾篩的吸頭避免此類污染。實驗室污染。實驗室污染。 現象：空白對照出現目的擴增產物空白對照出現目的擴增產物 對策： PCRPCR前后工序分室操作，試劑器材分室存放低溫貯存。前后工序分室操作，試劑器材分室存放低溫貯存。除酶及不能耐高溫的物質外，凡耐高溫的試劑器材均除酶及不能耐高溫的物質外，凡耐高溫的試劑器材均高壓滅菌。高壓滅菌。TipTip頭、頭、EppendorfEppendorf管等最好一次性使用。管等最好一次性使用。操作人員必須戴手套進行操作。操作人員必須戴手套進行操作。試劑小量分裝保存，用前先離心，操作時應小心輕柔，試

6、劑小量分裝保存，用前先離心，操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外防止開蓋防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外防止開蓋時液體濺出。時液體濺出。（2）逆轉錄逆轉錄RT-PCR（reverse transcription-PCR）逆轉錄酶：逆轉錄酶：AMV逆轉錄酶（最適溫度為逆轉錄酶（最適溫度為42）和）和MoMLV逆轉錄酶（最適溫度為逆轉錄酶（最適溫度為37）逆轉錄引物：逆轉錄引物：隨機引物；隨機引物；Oligo(dT)；特異；特異性引物。性引物。one-step RT-PCR：在同一體系中加入逆轉錄酶、在同一體系中加入逆轉錄酶、逆轉錄引物、逆轉錄引物、Taq DNA聚合酶、

7、聚合酶、PCR引物、引物、dNTP和緩沖液，直接以和緩沖液，直接以mRNA 為模板進行逆轉錄和為模板進行逆轉錄和PCR擴增，稱為一步法擴增，稱為一步法RT-PCR?；驹恚夯驹恚撼樘峒毎偝樘峒毎俁NA或或mRNA，在逆轉錄酶，在逆轉錄酶作用下合成作用下合成cDNA，通過，通過DNA末端轉移酶在末端轉移酶在cDNA 3端加上端加上poly(dG)尾。據此設計錨定引物尾。據此設計錨定引物poly(dC)，為提高擴增特異性，為提高擴增特異性，poly(dC)在十二聚以上，錨定在十二聚以上，錨定引物引物5端可加上某些限制性內切酶識別序列或其它端可加上某些限制性內切酶識別序列或其它序列信息。根據已知的序列信息。根據已知的3端序列設計基因特異性引端序列設計基因特異性引物，與錨定引物一起進行物，與錨定引物一起進行PCR擴增。擴增。用途：用途：檢測檢測T細胞受體和免疫球蛋白基因的多態性。細胞受體和免疫球蛋白基因的多態性。反向反向PCR已知序