1、長角血蜱卵cDNA表達文庫的構建劉光遠，田占成，才學鵬，李知新，謝俊仁，王 路，張 林，龔真莉（中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，蘭州 730046）摘要：【目的】以長角血蜱卵為材料構建高質量的長角血蜱卵cDNA表達文庫，為進一步篩選克隆目的基因奠定基礎。【方法】在無RNA酶污染的環境下從長角血蜱卵中提取RNA，進而純化mRNA，采取oligo（dT）引物合成雙鏈cDNA，定向克隆到SCREEN載體。用PhageMaker extract對其進行體外包裝以形成完整的噬菌體，轉染大腸桿菌ER1647，測定庫容量。并用構建的cDNA文庫克隆

2、已知的長角血蜱促卵泡激素基因。【結果】所構建長角血蜱卵cDNA表達文庫的基礎庫容量約為1.38106 PFU，重組率為100%，擴增后文庫的滴度為2109 PFUml-1。獲得了目的基因，其序列與GenBank中的長角血蜱促卵泡激素（DQ248886）的核苷酸序列的同源性為97.8%。【結論】成功構建了長角血蜱卵cDNA表達文庫。關鍵詞：長角血蜱；卵；cDNA表達文庫；構建Construction of cDNA Expression Library from Eggs of Haemaphysalis longicornisLIU Guang-yuan, TIAN Zhan-cheng, C

3、AI Xue-peng, LI Zhi-xin, XIE Jun-ren, WANG Lu, ZHANG Lin, GONG Zhen-li(Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province/State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046)Abstract: 【Object

4、ive】 cDNA expression library from eggs of Haemaphysalis longicornis was constructed for further screening and cloning of the potential candidate antigenic genes. 【Method】 Total RNA was isolated from eggs of H. longicornis, mRNA were purified, and cDNAs were synthesized and ligated to SCREEN vector.

5、The recombinant phage DNA was packaged by using Phagemark packaging extracts and then transfected to E. coli ER1647 to obtain the cDNA expression library. 【Result】The size of the primary cDNA library was 1.38106 PFU with titer of the amplified cDNA library of 2109 PFUml-1. A full length cDNA encodin

6、g follistatin-related protein was cloned from the cDNA library by PCR. 【Conclusion】The cDNA expression library from eggs of H. longicornis was successfully constructed.Key words: Haemaphysalis longicornis; Eggs; cDNA expression library; Construction0 引言【研究意義】蜱在攝食過程中，不僅給宿主造成直接損害，而且傳播多種病原體。由蜱傳播的新老疾病在對

7、畜牧業生產造成巨大經濟損失的同時，也引發了嚴重的公共衛生問題。因而，對蜱的控制非常必要1。傳統的控蜱方法主要是使用殺蟲劑，但由于長期使用某些殺蟲劑會使蜱產生抗藥性，加之殺蟲劑的使用對畜產品和環境所造成污染等問題，因而抗蜱疫苗的研制顯示出較好的應用前景2。為尋找高效、廣譜的抗蜱疫苗候選分子、描述蜱與宿主的免疫生物學特性，必須對蜱吸血、病原傳播及蜱與宿主之間的相互作用有更加深入的了解3。長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）主要分布在中國東北、華北、西北等廣大地區，是流行最廣泛和最重要的蜱種之一4，可傳播牛、羊泰勒屬（Theileria）和巴貝斯屬（Babesia）的多種病

8、原，防控長角血蜱具有重要的流行病學意義。【前人研究進展】在過去的30年，研究蜱與宿主相互作用的免疫生物學技術取得了很大進步。根據宿主對蜱叮咬獲得先天性或特異性免疫反應的機制，集中研究了相當多的單個蜱對宿主免疫系統的影響5,6。利用功能基因組和蛋白組學技術加速了對蜱、宿主、病原相互作用的研究步伐7。目前通過多種手段已經發現許多蜱的免疫相關因子813，但最成功且已商業應用的保護性抗原僅有抗微小牛蜱的Bm8614。【本研究切入點】蜱在不同發育階段及不同的組織，其表達的功能性抗原不盡相同，故以蜱的不同發育階段及其不同組織為材料構建的cDNA文庫為基礎，篩選蜱的免疫候選基因成為近期的研究熱點15,16。

9、目前的研究主要集中于蜱的唾液腺、中腸等組織，對蜱卵的基因研究較少。而卵是蜱發育的主要環節，同時卵也是蜱傳性病原在媒介蜱體內發育和傳遞的重要階段。與蜱生殖、發育循環相關分子可能成為蜱控制疫苗的候選抗原。【擬解決的關鍵問題】本研究選擇了以長角血蜱卵為材料，構建高質量的cDNA表達文庫，為進一步篩選克隆目的基因及蜱的生物學防治奠定基礎。真核生物mRNA表達具有時空特異性，因此如何選擇長角血蜱卵的適當發育時間，成為文庫構建的基礎；文庫中插入的外源片段的長度及完整性、所克隆的cDNA是否是來源于所構建的物種、在構建過程中是否是被污染等，是確保文庫質量的關鍵。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 長角血蜱

10、 多代培育的未感染血液原蟲的潔凈蜱，由蘭州獸醫研究所蟲種資源課題組傳代培養，將飽血雌蜱產后3周的卵用作試驗材料。1.1.2 實驗動物 家兔，蘭州獸醫研究所動物場提供。1.1.3 試劑 Trizol試劑（Invitrogen）；mRNA 純化試劑合（Amersham）；DEPC（Sigma）；定向表達寡脫氧胸腺核苷酸Orientexpress Oligo（dT）cDNA合成試劑盒（Novagen）；screen-1 EcoR/Hind載體臂及噬菌體蛋白包裝產物試劑盒（Novagen）；EcoR/Hind末端修飾試劑盒（Novagen）；DNA 連接試劑盒（Novagen）；柱層析片段純化試劑盒（

11、Novagen）；DNA 標準分子量（DL2000，Takara）。1.2 方法1.2.1 總RNA的提取 冰浴狀態下將約100 mg長角血蜱卵在1 ml Trizol中充分研磨。研磨物轉入離心管，在4以12 000g離心10 min，上清移入干凈離心管。水相的分離和RNA的沉淀、洗滌及溶解完全按相應說明書進行。取少量所提RNA用微量核酸蛋白檢測儀測定RNA（OD260/OD280）的純度及含量，并 對其進行凝膠快速分析。其余RNA置70保存備用。1.2.2 mRNA的純化 采用mRNA純化試劑盒，將所提取的RNA 適量溶解于1 ml TE buffer中，利用oligo（dT）-celluo

12、se柱純化mRNA，操作完全按說明書進行。將所純化mRNA沉淀重新溶解于無RNase的溶液中，用微量核酸蛋白檢測儀檢測mRNA 的純度及含量并進行凝膠快速分析，其余70保存備用。1.2.3 cDNA 的合成 在無菌、無RNase環境下，以8 g mRNA為模板、oligo（dT）為引物，在MMLV RT反轉錄酶作用下合成第一鏈cDNA；加入甲基化dNTP混合物、DNA聚合酶I和RNase H以合成第二鏈cDNA。取2 l cDNA用于瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余進行末端修飾。1.2.4 末端修飾 在T4 DNA聚合酶作用下補平cDNA的末端后，在其兩端連接EcoR/Hind 定向接頭，并用EcoR

13、/Hind 對接頭進行酶切，得到5端為EcoR，3端為Hind 酶切位點的雙黏性末端cDNA，便于與載體連接。1.2.5 柱層析選擇大片段cDNA及與載體的連接 將雙鏈cDNA通過凝膠過濾樹脂柱層析，以除去多余的接頭和長度小于300 bp的cDNA片段，收集大片段cDNA，將4 l cDNA與0.5 g SCREEN載體在16過夜連接，同時空白對照連接體系。1.2.6 重組噬菌體的體外包裝 將以上2組連接產物各適量分別與10 l PhageMaker extract 混勻22水浴孵育2 h進行體外包裝。向各包裝反應管中加入SM，使各管終體積為0.5 ml以終止反應，加25 l無菌氯仿顛倒混勻，

14、4保存。1.2.7 cDNA文庫的鑒定1.2.7.1 cDNA文庫基礎庫容量的測定 取上述包裝產物各1 l用SM溶液作梯度稀釋后轉染宿主菌ER1647，將這些噬菌體/細菌混合物與頂層瓊脂糖凝膠混勻，鋪LB平板37過夜培養。計數平板上噬斑數目，計算cDNA文庫的基礎庫容量。1.2.7.2 噬菌體文庫的擴增 文庫基礎庫容量測定后將0.45 ml噬菌體和2.5 ml宿主菌ER1647混勻，37靜止孵育15 min。加10 ml融化的頂層瓊脂糖鋪于直徑為150 mm的H agar平板上，當噬斑長到肉眼可見但互相不接觸時，用10 ml SM洗脫噬菌體。收集平板中所有SM到一無菌管中，加0. 5ml氯仿搖

15、勻。 3 000 r/min離心5分鐘取出瓊脂糖殘渣，將上清移入干凈管中（氯仿留于管底），取1 l測定擴增后噬菌體滴度。其余加DMSO到終濃度為7%，每管200 l分裝，70保存。1.2.7.3 cDNA文庫重組率的測定 從測定庫容量的平板上隨機挑取單噬斑50個，分別溶于25 l SM溶液中，室溫洗脫1 h，99加熱處理5 min。分別取5 l作為模板，用SCREEN-1載體SP6啟動子和T7終止子特異性引物進行PCR擴增。擴增條件為94預變性3 min；94 1 min，55 1 min，72 2 min，35個循環后72延伸6 min。1.2.7.4 文庫中特定目的基因的克隆與鑒定 長角血

16、蜱促卵泡素基因引物根據GenBank中該基因（DQ248886）序列參考設計，引物序列為：上游引物5 CGG TGC CGT TTA AAG ACG AC 3，下游引物5 TTA ATC CGA AAT ATT GTT GTT C 3；PCR反應體系同前。擴增參數：94預變性3 min；94 1 min，55 1 min，72 1 min，35個循環后72延伸6 min。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收DNA片段，與pGEM-T-Easy載體連接，轉化JM109感受態細胞，涂布于有X-gal和IPTG的Amp+ LB平板上，過夜培養，挑白色菌落，接種于

17、LB培養基中。經PCR鑒定后，測序。2 結果與分析2.1 RNA和mRNA試驗所提取RNA和mRNA經微量核酸蛋白檢測儀測定，RNA濃度為405 gml-1，OD260/OD280= 1.859；mRNA濃度為297 gml-1，OD260/OD280= 1.983。2.2 雙鏈cDNA檢測將所合成的雙鏈cDNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1，所合成cDNA呈集中于1002 000 bp 的瀑布狀。2.3 大片段cDNA的選擇對所收集的cDNA層析洗脫液用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，初始200 l洗脫液中無cDNA，其后加入250 lColumn buffer所收集的4管洗脫液1.

18、DL2000 marker；2. cDNA of H. longicornis；3. DL15000 marker圖1 雙鏈cDNA瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 1 Electrophoretic analysis of synthesized cDNA by agarose gel中均有cDNA出現（每管中約為60 l）。因第4管cDNA片段較小，故只將前3管中的cDNA片段合并到一管中抽提，進行與載體的連接反應。2.4 cDNA文庫的鑒定2.4.1 基礎庫容量和擴增文庫庫容量 當cDNA文庫稀釋度為10-3時，板上噬斑約為138個，則所構建長角血蜱卵cDNA表達文庫基礎庫容量約為1.3810

19、6 PFU。而稀釋度為10-3的空白對照包裝產物板上無噬斑生長，說明載體臂未發生自連；擴增后的文庫滴度為2109 PFUml-1。2.4.2 cDNA文庫重組率的測定 對隨機挑取的50個噬菌斑進行PCR鑒定，發現此文庫的重組率為100%，且大多數插入片段在0.52.5 kb之間，見圖2。1. DL2000標準分子量蛋白；213. 從文庫中隨機挑取的cDNA克隆1. DL2000 marker; 2-13. Random clones from the primary library圖2 文庫中隨機挑取的克隆中插入片段的PCR擴增Fig. 2 The PCR production of cDNA

20、 clones from the primary library2.4.3 目的基因的克隆、鑒定和序列分析 用新構建的cDNA文庫克隆已知的長角血蜱促卵泡激素基因，將其重組到pGEM-T-Eesy載體上，得到了與目的基因大小一致的片段。初步證明克隆得到了目的基因，進一步進行DNA測序，經DNAstar分析，促卵泡激素基因的開放閱讀框為815 bp，與GenBank上登錄的促卵泡激素cDNA（DQ248886）序列相比較6，發現其同源性為97.8%，推斷的氨基酸同源性為99%。其中6處T變為C，5處G變為A，3處A變為G，3處C變為T，1處G變為T。證明所克隆基因為全長的促卵泡激素基因cDNA。

21、3 討論理解蜱的發育過程對于研究蜱的生態、行為、蜱-病原的相互作用、媒介生物學、蜱-宿主相互作用機制以及蜱傳病預防和控制來說是重要的。如卵黃形成和蛻皮進化是蜱完成生殖、發育循環的主要方式，有證據表明節肢動物生殖的成功主要依賴于激素調控下的卵黃形成，卵黃蛋白是胚胎發育的主要營養源以及蛻皮相關分子17，有預防病原入侵，調控蜱中腸內腔形成的圍食膜18和蜱吸血、蛻皮時期的其它必要功能的作用，故與蜱生殖，發育循環相關分子可能成為蜱控制疫苗的候選抗原。真核生物mRNA表達具有時空特異性，因此隨著時間的推移，長角血蜱卵快要成熟時其表達的蛋白種類及濃度達到最高峰。利用這一點可使一些低豐度的mRNA得到富集，使

22、得篩選免疫基因的工作變得順利。一個文庫的質量如何，主要看其所插入的外源片段的長度及其完整性以及所克隆的cDNA是否是構建物種來源的。如果該文庫在構建過程中被污染，則合成的cDNA質量差，直接導致文庫庫容量高，但其所插入的外源基因卻并不是需要的。為此，本試驗在嚴格無菌的條件下提取長角血蜱卵總mRNA，繼而合成cDNA。進一步對所構建好的文庫作了相關數據的檢測，以確保文庫的高質量。cDNA表達文庫質量直接影響對目的基因篩選的成敗。理論上，cDNA文庫的容量為4.61044.6105 PFUml-1時，得到目的克隆的概率為99%，從而可篩選出各種目的cDNA基因片段。本研究所構建的長角血蜱卵cDNA

23、文庫，經對庫容量、重組率及其插入片段長度進行的檢測，構建的文庫的庫容量為1.38106 PFU，擴增后文庫的滴度分別為2109 PFUml-1，插入的片段長度在5002 500 bp之間，且blank（no insert）、Control Insert及PhageMaker Control DNA等對照板上的噬斑生長情況也證實了所構建的cDNA文庫質量很高，在理論上完全滿足構建文庫的要求。用已知長角血蜱基因的引物，從構建的cDNA表達文庫中成功地克隆到長角血蜱促卵泡激素基因完整閱讀框，表明該文庫質量高，具有一定代表性和多樣性，為從文庫中高通量地篩選和發現未知新基因奠定了基礎。4 結論本研究以長

24、角血蜱卵為材料構建了高質量的cDNA表達文庫。經測定，基礎庫容量約為1.38106 PFU，重組率為100%，擴增后文庫的滴度為2109 PFUml-1。對文庫用已知的促卵泡激素引物進行擴增，得到長角血蜱促卵泡激素全長cDNA序列。結果表明：長角血蜱卵cDNA表達文庫已成功構建，適合于進一步篩選具有免疫學功能的新基因。References1Sonenshine D E. Biology of Ticks. (vol. 2), New York: Oxford University Press, 1993.2Mulenga A, Sugimoto C, Onuma M. Issues in ti

25、ck vaccine development: identification and characterization of potential candidate vaccine antigens. Microbes Infection, 2000, 2(11): 1353-1361. 3Opdebeeck J P. Vaccines against blood-sucking arthropods. Veterinary Parasitology, 1994, 54(1-3): 205-222.4鄧國藩, 姜在階. 中國經濟昆蟲志, 第39冊, 蜱螨亞綱硬蜱科. 北京: 科學出版社, 19

26、91: 34-43.Deng G F, Jiang Z J. Economic Insect Fauna of China: Acari: Ixodiate. Fasc 39. Beijing: Science Press, 1991: 34-43.(in Chinese)5Nuttall P A. Displaced tick-parasite interactions at the host interface. Parasitology, 1998, 116(Suppl.): 65-72.6趙忠芳, 孔繁瑤, 楊漢春, 紀炳純. 動物對長角血蜱幼蟲感染的免疫應答. 寄生蟲與醫學昆蟲學報,

27、 2000, 7(1): 50-56.Zhao Z F, Kong F Y, Yang H C, Ji B C. Immunity reaction against the hard tick Haemaphysalis longicornis larva infection. Acta Parasitologica et Medica Entomologica Sinica, 2000, 7(1): 50-56. (in Chinese)7Narasimhan S, Montgomery R R, DePonte K, Tschudi C, Marcantonio N, Anderson J

28、 F, Sauer J R, Cappello M, Kantor F S, Fikrig E. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United states of America, 2004, 101(5): 1141-1146.8Tsuda A, Mulenga A, Sugimoto C, Nakajima M, Ohashi K, Onuma M. cDNA cl

29、oning, characterization and vaccine effect analysis of Haemaphysalis longicornis tick saliva proteins. Vaccine, 2001, 20, 19(30): 4287-4296.9Miyoshi T, Tsuji N, Islam M K, Kamio T, Fujisaki K. Cloning and molecular characterization of a cubilin-related serine proteinase from the hard tick Haemaphysa

30、lis longicornis. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 34(8): 799-808.10Karim S, Ramakrishnan V G, Tucker J S. Amblyomma americanum salivary glands: double-stranded RNA-mediated gene silencing of synaptobrevin homologue and inhibition of PGE2 stimulated protein secretion. Insect Biochemis

31、try and Molecular Biology, 2004, 34(4): 407-413.11Willadsen P, Bird P, Cobon G S, Hungerford J. Commercialisation of a recombinant vaccine against Boophilus microplus. Parasitology, 1995, 110(Suppl.): S43-S50.12Wang H, Nuttall P A. Excretion of host immunoglobulin in tick saliva and detection of IgG

32、-binding proteins in tick haemolymph and salivary glands. Parasitology, 1994, 109(4): 525-530. 13Wang H, Nuttall P A. Immunoglobulin G binding proteins in male Rhipicephalus appendiculatus ticks. Parasite Immunology, 1995, 17(10): 517-24. 14Willadsen P, Smith D, Cobon G, McKenna R V. Comparative vaccination of cattle against Boophilus microplus with recombinant antigen Bm86 alone or in combination w