1、豬瘟病毒實時熒光定量RT PCR檢測方法的建立和初步應用李軍,潘艷,禤雄標,胡帥,馬春霞,謝宇舟,陳澤祥,許力干,謝永平,楊威(廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530001摘要:根據(jù)G enBank公布的豬瘟病毒基因組5 非編碼區(qū)基因序列進行同源性比較分析,選擇保守序列區(qū)作為擴增區(qū)域,設計1對特異性擴增引物,通過優(yōu)化反應條件,建立了一個用于豬瘟病毒快速定量檢測的SY BR Gr een 熒光定量RT P CR 方法。試驗結(jié)果表明該方法重復性好,反應批內(nèi)循環(huán)閾值差異不顯著。與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型等豬源病毒無交叉反應,具有高度的特異性,而且靈敏度高,最小檢出量為2 102

2、病毒基因組拷貝數(shù)。利用此方法對15例臨床樣本進行檢測,其結(jié)果與兔體交叉免疫試驗一致,表明此方法可作為豬瘟實驗室快速診斷和疫情監(jiān)測的一種快速、準確、簡便的檢測工具。關(guān)鍵詞:豬瘟病毒;實時熒光定量RT PCR中圖分類號:Q78 文獻標識碼:A 文章編號:1671 7236(201103 0116 04豬瘟病毒(classical sw ine fev er virus,CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬,是豬的一種重要傳染性疾病病原,豬是本病的唯一宿主,病豬和帶毒豬是最主要的傳染源,直接接觸是病毒傳播的主要方式。豬瘟發(fā)病特征為發(fā)病急,高熱稽留和細小血管壁變性,引起全身廣泛性小點出血,脾梗死,具有很高的發(fā)

3、病率和死亡率,對養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失,被世界動物衛(wèi)生組織列為A類傳染病,是國際貿(mào)易重要檢疫對象之一(Meuw issen等,1999。目前,CSFV的檢測方法主要有3大類,即兔體交叉免疫試驗、基于病毒抗原和抗體反應的血清學診斷方法和針對病毒核酸檢測的PCR技術(shù)(梁仕巖等,2009。兔體交叉免疫試驗和血清學診斷方法檢測病毒抗原雖然具有一定的靈敏度,但是操作繁瑣,周期較長。PCR可以檢測血液、糞便、分泌物中CS FV的核酸,實現(xiàn)早期診斷,在CSFV的檢測中發(fā)揮重要的作用(傅烈振等,1998;張朝紅等,2007;劉建柱等,2003。近年來發(fā)展起來的實時熒光定量PCR檢測技術(shù)將PCR與熒光檢測結(jié)

4、合起來,克服了傳統(tǒng)PCR的假陽性和不能準確定量等弊端,可對樣本中的核酸進行準確的定量檢測,具有操作簡單、結(jié)果直觀、準確定量等優(yōu)點,已經(jīng)成為病原體檢測的收稿日期:2010 08 20作者簡介:李軍(1971-,男,廣東人,副研究員,博士,主要從事動物疫病防治研究。通信作者:楊威。基金項目:廣西自然科學基金(0728103。一個重要方法(O M ahony等,2002;Whelan等, 2003。本試驗根據(jù)SYBR Green 熒光定量分析原理,對CSFV核酸進行實時熒光定量PCR分析,建立了一種快速、準確、特異的CSFV定量檢測方法,實現(xiàn)了快速、靈敏和準確地檢測CSFV的基因組拷貝數(shù),為CSFV

5、的早期快速診斷提供了有力的工具。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 毒株 豬瘟兔化弱毒疫苗為廣西獸醫(yī)研究所實驗室保存。1.1.2 主要儀器和試劑 iCycler iQ TM熒光定量PCR儀(美國Bio Rad公司、PCR儀(日本TaKa Ra公司、凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Ino tech公司、生物分光光度計(德國Eppendorf公司。Real M aster M ix熒光定量PCR試劑盒(SYBR購自天根生化科技有限公司,DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自廣州某生物科技有限公司, pMD18 T載體、RNA酶抑制劑(40U/ L購自大連寶生物公司。T rizo l購自美國In

6、vitr ogen公司, M LV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/ L為美國Pro mega公司產(chǎn)品。1.2 方法1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank公布的25株CSFV基因組5 非編碼區(qū)基因序列進行同源性比較分析,選擇保守序列區(qū)作為擴增區(qū)域,利用Oligo6.0引物設計軟件和BLAST軟件程序設計出特異性擴增引物,預期擴增大小為96bp。引物序列為:CSFV 1:5 GCCCATAGTA GGACTAG CA 3 ;CSFV 2:5 CGAACTA CT GA CGACT GT C 3 ,由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。1.2.2 病毒RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄 CSFV RNA 的提取按照I

7、nvitr ogen 公司的T rizol 提取說明進行。按李軍等(2005介紹的方法進行反轉(zhuǎn)錄。1.2.3 實時熒光定量PCR 條件的優(yōu)化 在iCy cler iQ TM 熒光定量PCR 儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析,對不同退火溫度(5559 進行優(yōu)化,然后,以優(yōu)化的退火溫度分別對不同引物濃度(2.5、5、25pm ol/ L 進行優(yōu)化,確定其最佳引物濃度。1.2.4 熔解曲線分析 為排除非特異性擴增和引物二聚體的形成對實時熒光定量PCR 結(jié)果造成影響的可能性,在PCR 后進行熔解曲線分析以確定引物的特異性和所得產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物。溫度以0.5 /10s 的速率從55 緩慢遞增到94 ,連續(xù)測定樣

8、品的熒光強度以獲取熔解曲線。反應結(jié)束后取6 L 產(chǎn)物進行電泳,判斷有無96bp 的特異性條帶出現(xiàn)。1.2.5 標準品的制備和標準曲線的建立 以優(yōu)化的反應條件對CSFV RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 進行常規(guī)PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳,GelRed 染色,凝膠成像系統(tǒng)檢測,在紫外燈下切取目的片段,利用DNA 膠回收試劑盒回收純化目的片段。將回收純化的目的片段與pMD18 T 載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5 ,用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,經(jīng)酶切和PCR 鑒定后,將陽性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。純化陽性重組質(zhì)粒,測D 260nm 值后,將陽性重組質(zhì)粒進行10倍

9、梯度稀釋,采用優(yōu)化的反應條件進行實時熒光定量PCR,循環(huán)閾值(Ct設定原則為超過陰性對照擴增曲線(無規(guī)則噪音線的最高點。Ct 值>35為陰性,Ct 值<35為陽性。熒光定量PCR 儀會根據(jù)各個標準品測得的Ct 值,以樣本拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標,以Ct 值為縱坐標建立標準曲線。1.2.6 特異性、準確性和穩(wěn)定性試驗 分別提取CSFV 、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型共4種病毒的核酸,用優(yōu)化的反應條件進行熒光定量PCR,檢測本方法的特異性。分別重復6次檢測含量為2.0 106、2.0 105和2.0 104拷貝/ L 的CSFV 陽性重組質(zhì)粒,評價本方法的準確性和穩(wěn)

10、定性。1.2.7 實時熒光定量RT PCR 的臨床應用 應用 本方法對15份臨床疑似豬瘟樣本進行檢測,在檢測的15份樣本中,有6份樣本經(jīng)兔體交叉免疫試驗證實為豬瘟病毒陽性。2 結(jié)果2.1 熒光定量PCR 條件的優(yōu)化 分別對退火溫度和引物濃度進行優(yōu)化,獲得了CSFV 的熒光定量PCR 最佳反應條件和體系。總反應體系為25 L,其中Real M aster M ix 11 L 、上下游引物(5pmo l/ L各0.5 L 、cDNA 模板2.5 L 以及ddH 2O 10.5 L 。反應條件:95 預變性5m in;隨后進行40個95 20s,57 20s,68 20s 的循環(huán);最后68 延伸5m

11、in 。2.2 熔解曲線分析 熔解曲線只有1個特異峰(圖1,排除了非特異性產(chǎn)物和引物二聚體形成對結(jié)果帶來影響的可能,同時說明設計的引物具有很好的特異性,PCR 反應條件得到了很好的優(yōu)化。PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示為單一條帶,大小與預期擴增片段大小一致(圖2,可以判斷PCR 為特異性擴增。2.3 標準品的制備和標準曲線的建立 CSFV RN A 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后,進行PCR 擴增,PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后,與pMD18 T 載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5 ,用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,測序結(jié)果表明擴增序列與參考序列一致。抽提陽性重組質(zhì)粒,測D 260nm 值。根據(jù)分子質(zhì)量及阿佛加德羅常數(shù)(

12、6.023 1023分子數(shù)/m ol換算為分子拷貝數(shù),按2 1010拷貝/ L 濃度的陽性重組質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋,采用優(yōu)化的反應條件進行實時熒光定量PCR 擴增(圖3,當模板濃度為2 102拷貝/ L 時,仍有熒光曲線,表明該方法檢測靈敏度為2 102拷貝/ L。 圖3 熒光定量PC R 的擴增曲線以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標,以Ct 值為縱坐標,得到標準曲線Ct =- 3.145 lo g 拷貝數(shù)+ 4.975(圖4。標準曲線的斜率為-3.145,截距為4.975。通過從儀器讀取待測樣品的Ct 值,代入表達式就可以換算出其初始拷貝數(shù)。 圖4 CSFV 實時熒光PCR 的標準曲線2.4 實時熒光

13、定量PCR 的特異性 分別提取CS FV 、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型共4種病毒的核酸進行實時熒光定量PCR,僅有CSFV 的擴增有擴增曲線產(chǎn)生,其余3種病毒的擴增均無擴增曲線出現(xiàn),說明本方法有很好的特異性。2.5 實時熒光定量PCR 的準確性和穩(wěn)定性試驗 用2.0 106、2.0 105和2.0 104拷貝/ L 的標準樣品同時進行實時熒光定量PCR,分別重復6次檢測。它們的Ct 值分別為19.77+0.25、22.64+0.22、25.16+0.27,變異系數(shù)分別為1.26%、0.97%和1.07%,均小于5%,表明本方法具有較好的準確性和穩(wěn)定性。2.6 實時熒

14、光定量RT PCR 的初步應用 應用本研究建立的實時熒光定量RT PCR 方法從15份臨床疑似豬瘟樣本中檢測到6份豬瘟病毒陽性樣本,其結(jié)果與兔體交叉免疫試驗一致。同時利用其它豬瘟病毒特異性診斷引物對這15份臨床樣本進行了RT PCR 檢測,其結(jié)果也與實時熒光定量RT PCR 的結(jié)果完全一致,說明熒光定量RT PCR 的準確性達到100%(廖素環(huán)等,2005。3 討論熒光定量PCR 的檢測方法有二種,一種是以T aqMan 探針為代表的雜交探針檢測,另一種是以SYBR Gr een 為代表的染料檢測(Bhudevi 等,2001;M art nez 等,2008。SYBR Green 染料可以與

15、雙鏈DNA 的小溝結(jié)合,在波長497nm 下發(fā)射熒光信號,而且熒光強度的增加與雙鏈DNA 的數(shù)量成正比,而未與雙鏈DNA 結(jié)合的SYBR Green 染料分子不會發(fā)射熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR 產(chǎn)物的增加完全同步,達到實時定量的目的。與普通PCR 相比,SYBR Green 熒光定量PCR 的核酸擴增和檢測都在同一管內(nèi)進行,無需電泳檢測PCR 產(chǎn)物,解決了PCR 假陽性和核酸染料溴化乙錠對環(huán)境的污染問題。整個檢測過程可在1h 內(nèi)完成,僅為普通PCR 檢測時間的一半,從病料到結(jié)果檢測只需2.5h,能滿足臨床上豬瘟診斷的快速要求。與雜交探針熒光定量PCR 相比,SYBR Green

16、染料可以適用于任何基因的PCR 擴增,無需設計特定的探針序列,價格成本低廉。由于SYBR Gr een 染料與雙鏈DNA 結(jié)合沒有特異性,容易產(chǎn)生非特異性擴增,因此需要優(yōu)化PCR 反應條件和得到單一的熔解曲線來增強檢測的靈敏度和精確度(Simpso n 等,2000。本試驗通過優(yōu)化PCR 反應條件,在PCR 退火溫度為57 ,引物濃度為5pm ol/ L 時,獲得的熔解曲線只有一個特異峰,表明了該反應為特異性擴增,沒有引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)。 熒光定量PCR 的靈敏度檢測結(jié)果表明,本試驗建立的方法最小檢出量為2 102病毒基因組拷貝數(shù)/ L 。在特異性試驗中該方法與豬

17、繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型等常見的豬源病毒不存在交叉反應,說明本方法特異性強。對標準品分別重復6次檢測,結(jié)果表明該檢測方法具有良好的準確性和穩(wěn)定性。將該方法用于臨床樣本的檢測,其結(jié)果與兔體交叉免疫試驗的結(jié)果一致。因此,本試驗建立的具有高靈敏度和高特異性的熒光定量RT PCR 檢測方法能為豬瘟實驗室快速診斷和疫情監(jiān)測提供一種快速、準確、簡便的檢測工具。參考文獻1 劉建柱,崔玉東,刑華偉,等.RT PCR與兔體交叉試驗檢測豬瘟病毒感染的相關(guān)性研究J.中國獸醫(yī)科技,2003,11:1621.2 張朝紅,張彥明,張永國,等.豬瘟病毒4種檢測方法的比較J.西北農(nóng)林科技大學學報(自

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19、r detection and classification of bovine viral diarrh ea virusJ.Vet M icrobiol,2001,83:110.8 M art nez E,Riera P,Sitj M,et al.Sim ultaneous detection andgen otypin g of p or cine reproductive an d res piratory s yndrome vi rus(PRRSVby real time RT PCR and amplicon meltin g curve analysis using S YBR

20、 GreenJ.Res Vet S ci,2008,85:184 193.9 M euw issen M P,H orst S H,H uirne R B,et al.A model to es timate the financial consequen ces of classical sw ine fever ou t breaks:prin ciples and outcomesJ.Prev Vet M ed,1999,42,249 270.10O M ah ony J,Hill C A.Real tim e PCR assay for the detection an d quant

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22、183.12Wh elan J A,Rus sell N B,Whelan M A.A method for th e abs o lute quantification of cDNA u sing real tim e PCRJ.J Immun ol M eth ods,2003,278:261269.Establishment and Application of Real time Fluorogenetic Quantitative RT PCR for Detection of Classical Swine Fever VirusLI Jun,PAN Yan,XU AN Xion

23、g biao,H U Shuai,M A Chun xia,XIE Yu zhou,CH EN Ze x iang,XU Li g an,XIE Yong ping,YANG Wei(Guang x i V eterinar y Research Inst itute,N anning530001,ChinaAbstract:T o establish a real t ime fluor og enetic quantitat ive RT PCR assay fo r detect ion of classical sw ine fever vir us(CS F V,t he5 no n

24、 t ranslated region sequences o f CSF V in GenBank were aligned and a pair of specific pr imers was desig ned fro m the conserv ed sequence w ithin5 non tr anslated r egion.T he reactive co ndit ions w ere o ptimized t o impr ov e the sensit ivity and specificit y o f the assay.T he r esults o f rep

25、roducibility of this assay wer e reliable and the intr a assay v ariat ions w ere not sig nifi cant.T he specificity test pr oved that this assay had a hig h specificit y w hich could not detected PRRSV,PRV and PCV2.T he assay also pr oven to be specific,and the detectio n limit was up to2 102copies.T he accuracy of real time fluor og enetic quanti tat ive R