1、    慢性馬兜鈴酸腎病大鼠模型腎組織中蛋白質組的差異表達(1)    】 目的： 制備慢性馬兜鈴酸腎病的大鼠模型，建立馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織和正常大鼠腎組織的雙向電泳圖譜，從而展示差異表達的蛋白質，為進一步篩選介導馬兜鈴酸毒性作用的蛋白質分子奠定基礎. 方法：應用馬兜鈴酸腹腔注射制備大鼠慢性馬兜鈴酸腎病模型，提取其腎組織中總蛋白質，采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，對模型組和正常組腎組織中蛋白質進行差異展示. 結果：成功制備了慢性馬兜鈴酸腎病大鼠模型，并建立了模型組和正常組大鼠腎組織的雙向電泳圖譜，發現了差異蛋白質

2、. 結論：馬兜鈴酸導致大鼠腎組織中蛋白質差異表達，這些差異表達的蛋白質可能介導了馬兜鈴酸的毒性作用.【關鍵詞】 馬兜鈴酸；大鼠；腎組織；雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質組【中圖號】 R587.10引言自Vanhrweghem等1報道了因減肥藥引起“中草藥腎病（Chinese herbs nephropathy，CHN）”以來，含馬兜鈴酸成分的中草藥所致的腎損害馬兜鈴酸腎病（aristolochic acid nephropathy，AAN）越來越受到了國內外學者的廣泛重視. 由于一些常用中草藥及中成藥都含有馬兜鈴酸，因而由馬兜鈴酸引起的腎損害在臨床上十分常見2. 急性AAN主表現為急性腎小管壞死

3、，慢性AAN表現為寡細胞性腎間質纖維化2-3，病情多為不可逆性，而且即使停服藥物，其腎損害仍然繼續進展4-5. 絕大多數患者很快或逐漸進入終末期腎衰，需腎臟替代治療. 因此闡明馬兜鈴酸腎損害的分子機制，以進行早期的診斷和治療（在蛋白質或基因水平進行干預和阻斷）將是緩解馬兜鈴酸腎損害的關鍵. 為此，我們建立慢性馬兜鈴酸腎病模型，用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選和比較馬兜鈴酸誘導的差異蛋白質分子，為馬兜鈴酸導致腎損害的分子靶點研究奠定基礎.1材料和方法1.1材料雌性Wistar大鼠，2024 wk齡，體質量190210 g（第四軍醫大學實驗動物中心）；馬兜鈴酸制劑：用馬兜鈴酸標準品（中國生物制品研究所

4、提供）配制成0.5 g/L的溶液,高壓滅菌, 置冰箱4下保存備用. 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、三（羥甲基）氨基甲烷、苯甲基磺酰氟（華美生物工程公司）；超純尿素（上海生物工程公司產品）；兩性電解質pH 58（上海麗珠東風技術有限公司）；DYY26型雙向電泳槽和梯度混合器（北京六一廠）；電泳儀（BioRad公司）.1.2方法1.2.1慢性馬兜鈴酸腎病動物模型的建立根據文獻6進行，將Wistar大鼠隨機分為2組. 馬兜鈴酸組（n=30）：每只大鼠腹膜內注射馬兜鈴酸,劑量為5 mg/(kgd)，共16 wk. 在用藥開始后第8，12，16，20，24 wk分別處死6只大鼠. 正常對照組（n=5

5、）：每只大鼠腹膜內注射生理鹽水2 mL/d，共16 wk，在第24 wk實驗結束時處死. 大鼠在處死時留取腎臟標本，-70冰箱保存，用以作腎臟病理檢查.1.2.2蛋白質樣品的準備在用藥開始后第12 wk處死大鼠，取其腎臟，具體方法為：將大鼠乙醚麻醉，開腹，分離出鼠雙側腎臟，自腎動脈用冰生理鹽水在體對腎臟進行灌注直至腎臟發白，取出腎臟用濾紙吸去多余液體，然后用電子天平稱質量后，按照比例加入組織裂解液，冰浴上勻漿，靜置，離心，用Lowry法測定上清液中總蛋白含量，吸取上清液分裝，-70凍存.    1.2.3雙向電泳（2D PAGE）首先進行等電聚焦(IEF

6、)：取17 cm IPG膠條(pH 58)在加有樣品的泡漲液中以被動式泡漲1216 h，用PROTEAN IEF Cell等點聚焦儀進行第一向電泳. IEF結束后，IPG膠條置含有DTF的平衡液中；然后進行SDSPAGE電泳：預先制備垂直電泳用凝膠，將進行完IEF并平衡后的膠條轉移至凝膠的上方，用10 g/L熱瓊脂糖溶膠封固. 在PROTEAN II Xi垂直電泳槽的上下槽中加入電極緩沖液后按照預設程序進行電泳，直至溴酚藍前沿距下緣0.5 cm時停止電泳. 最后參照BioRad推薦的硝酸銀染色方法進行染色. 凝膠通過Imagescanner掃描儀以及LabScan掃描軟件進行掃描獲取圖像，利用

7、PDQUEST圖像分析軟件對電泳結果進行分析，圖像分析包括蛋白質斑點的檢測、編輯、背景扣除和點的匹配等.統計學處理： 所有數據的統計分析在SPSS 10.0軟件和Excel上進行.2結果2.1慢性馬兜鈴酸腎病模型的鑒定馬兜鈴酸組用藥后8 wk，腎小球、腎小管間質、腎血管均未見損害；用藥后12 wk，腎小球未見改變，部分腎小管上皮細胞發生空泡變性；用藥后16 wk，腎臟近曲小管上皮細胞明顯腫脹，管腔縮小，并伴有部分腎小管上皮細胞壞死及凋亡；20 wk時腫脹的小管上皮細胞逐漸縮小，部分遠曲小管出現擴張，個別腎小管萎縮，但未見間質出現纖維化；24 wk時可見較多腎小管出現萎縮，腎間質出現多灶性纖維化

8、（圖1）.            作者：孫世仁，陳光磊，寧曉暄,陳威 【關鍵詞】馬兜鈴酸；大鼠；腎組織；雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質組Different         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。2.2馬兜鈴酸誘導的大鼠腎組織中蛋白質組的

9、差異表達根據馬兜鈴酸處理后大鼠不同時間腎組織病理改變的結果提示，腎臟于12 wk開始出現早期的病變，因此取12 wk時的腎組織進行雙向電泳. 在二維平面上將小鼠腎臟組織蛋白質進行分離，得到2D電泳圖譜（圖2），正常對照組和馬兜鈴酸腎病模型組的匹配率為83.4%，有大量蛋白質點相對含量增加或降低，或新出現，其中87個蛋白質點在模型組比正常組上調2倍，18個蛋白質點上調5倍以上，73個蛋白質點下調2倍. 部分表達差異的蛋白點數據見表1，其中蛋白質點1271，1823和2001在正常組弱表達，而在模型組高表達；蛋白質點1567和1789在正常組中無表達，而在模型組出現表達；蛋白質點1398在模型組中

10、表達低于正常組.圖1正常對照組和馬兜鈴酸組大鼠腎組織Masson ×400（略）圖2馬兜鈴酸大鼠腎組織的雙向電泳圖（略）表1正常組和馬兜鈴酸腎病模型組部分差異蛋白質點（略）3討論我國學者早在1964年就發現了木通致急性腎衰（ARF）的病例，但由于僅為個例報道，無臨床與病理分析，故未引起重視. 由于一些常用中草藥及中成藥都含有馬兜鈴酸，如關木通、廣防己、青木香、天仙藤、馬兜鈴、尋骨風、朱砂蓮及龍膽瀉肝丸、二十五味松石丸、十香返生丸、大黃清胃丸、小兒金丹片、止咳化痰丸、分清五淋丸、安陽精制膏、導赤丸、婦科分清丸、純陽正氣丸、冠心蘇合丸、排石顆粒、跌打丸等，因而由馬兜鈴酸引起的腎損害在臨床

11、上十分常見. 北京中日友好醫院報道，由馬兜鈴酸引起的慢性AAN占其全科慢性腎小管間質疾病的80%，此病很可能是我國最常見的慢性腎小管間質疾病2, 目前尚無有效的治療. 因此，尋找出馬兜鈴酸導致腎臟損害的始動分子，進而早期診斷和治療（在蛋白質或基因水平進行干預和阻斷）將是解決馬兜鈴酸腎損害的關鍵，也正是我們的研究目標.差異蛋白質組學是蛋白質組學研究的重方面，它是著重于尋找和篩選多個樣本之間的差異蛋白質譜,揭示細胞生理和病理狀態的進程與本質、對外界環境刺激的反應途徑以及細胞調控機制,同時獲得對某些關鍵蛋白的定性和功能分析，因此差異蛋白質組學為一些疾病的病因學和治療學的研究提供了很好的思路. 雙向凝

12、膠電泳和質譜技術是當前分離鑒定蛋白質的兩大支柱技術. Kennedy7利用蛋白質組學技術研究了慶大霉素處理組蛋白質所發生的特異性的變化，結果得到了一些新的蛋白質標志物. Aicher等8利用該技術分析了環孢菌素A處理后鼠的腎臟，鑒別出一種新的鈣結合蛋白，而該蛋白可能作為腎臟毒性的一個新的標志物. 差異蛋白質組學的研究同樣也適用于中藥毒性分子靶點的篩選和鑒定. 為此，我們在建立慢性馬兜鈴酸腎病模型的基礎上用雙向電泳技術篩選和比較模型動物腎組織中馬兜鈴酸誘導的差異蛋白質分子，為進一步尋找馬兜鈴酸導致腎損害的分子靶點奠定基礎.我們利用雙向電泳系統，對馬兜鈴酸誘導腎間質纖維化早期（12 wk）大鼠模型

13、的腎組織和正常大鼠腎組織進行蛋白差異展示，軟件分析顯示雙向電泳圖譜的匹配率可達83.4%，同時出現差異明顯的蛋白質點，提示這些差異表達的蛋白質可能參與馬兜鈴酸腎損害早期過程，可能是毒性作用的始動分子. 我們還需對這些差異蛋白質分子進行質譜鑒定及功能研究，才能尋找出真正介導馬兜鈴酸毒性作用的蛋白質分子.【參考文獻】1 Vanherweghem JL, Depierreux M, Tielemans C, et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming

14、regimen including Chinese herbsJ. Lancet, 1993,341(8842):387-391.2 陳文, 諶貽璞, 李安, 等. 馬兜鈴酸腎病的臨床與病理表現J. 中華醫學雜志, 2001,81(18): 1101-1105.3 陳文, 諶貽璞. 馬兜鈴酸腎病J. 中華內科雜志,2001,40:426-427.4 尹廣, 胡偉新, 黎磊石. 木通中毒的腎損害J. 腎臟病與透析腎移植雜志, 1999,8:10-14.5 Strihou C, Vanherweghem JL. The tragic paradigm of Chinese herbs nephropathyJ. Nephrol Dial Transplant,1995,10(2):157-160.6 鄭法雷,張曉明,黃慶元. 慢性馬兜鈴酸腎病動物模型的建立及其意義J. 中華醫學雜志, 2001,81:1095-1100.7 Kennedy S. Proteomic profiling from human samples: the