1、成纖維細胞生長因子受體3在脂多糖抑制成骨細胞分化中作用的初步研究 10-05-12 10:54:00 編輯：studa20 作者：楊京，趙子瑜，何啟芬，陳林【摘要】 目的 本實驗擬通過研究激活成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)信號通路時骨組織成骨細胞分化程度在內毒素血癥中的變化，為進一步闡明骨組織在炎癥反應中變化的機制奠定基礎。方法 8周齡雄性C57小鼠和FGFR3功能持續增強的軟骨發育不全(Ach)小鼠各6只，分為脂多糖(LPS)組和生理鹽水對照組，每組3只。LPS 15mg/kg或等量生理鹽水腹腔注射4小時后取右側脛骨提取RNA，定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測白細胞介素6(IL6)、

2、腫瘤壞死因子(TNF)、骨鈣素(OC)的變化。LPS、堿性成纖維生長因子(bFGF)處理前成骨細胞系MC3T3E1 4小時后定量PCR檢測IL6、TNF、OC水平，成骨誘導7天后檢測堿性磷酸酶(ALP)活性。結果 LPS刺激后，骨組織和MC3T3E1的炎癥遞質基因IL6、TNF的RNA水平顯著增加(P0.01)，成骨標志性基因OC表達下調(P0.05)。且Ach小鼠相應基因變化幅度顯著高于C57的變化幅度(P0.05)。MC3T3E1同時用LPS與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)處理組的IL6、TNF、OC水平表達水平位于單獨用LPS或bFGF組之間。成骨誘導7天后LPS處理組細胞ALP活性

3、顯著低于未處理組(P0.05)，bFGF處理組顯著增高(P0.01)。結論 LPS刺激骨組織發生炎癥反應、抑制成骨細胞分化。在整體動物水平持續性激活FGFR3信號通路加重上述反應，在細胞水平低劑量bFGF激活FGFR3減輕上述反應。 【關鍵詞】 脂多糖;骨;成骨細胞;成纖維細胞生長因子受體3Abstract： Objective This experiment focuses on the differentiation of osteoblasts in the endotoximia while the FGFR3 pathway is activating,so as to unders

4、tand the change of bone tissue in inflammation.Methods Six male C57 mice and 6 male Ach mice (persistently activating function of FGFR3),8 weeks old,were divided into normal saline(NS) group and lipopolysaccharide(LPS) group,3 mice per group.RNA was extracted from the right tibias 4 hours after LPS

5、or physiological saline injection,and then the levels of interleukin 6(IL6),tumor necrosis factor (TNF),osteocalcin (OC) in tibia and osteoblast were measured by quantitative realtime PCR.Four hours after the preosteoblast cell line MC3T3E1 was cultured with LPS and bFGF,the levels of IL6,TNF,OC in

6、tibia and osteoblast also were measured by quantitative realtime PCR.The MC3T3E1 activities of alkaline phosphatase(ALP) were detected 7 days after culture.Results Both of the levels of IL6 and TNF in tibias and MC3T3E1 were increased while the levels of OC in tibias and MC3T3E1 were decreased 4 hou

7、rs after LPS administration(P0.01).The expression change was more huge in Ach mice(P0.05).The expressions of IL6,IL1 and OC in MC3T3E1 cultured with LPS and bFGF were higher than those cultured only with LPS and lower than those only with bFGF.Compared with the untreated group,the activity of ALP in

8、 MC3T3E1 was decreased in LPS group(P0.05) and increased in bFGF group(P0.01).Conclusion LPS could involve bone tissue in inflammation and inhibit the differentiation of osteoblast.Persistently activating the function of FGFR3 in vivo could aggravate these effects.And low dose of bFGF in vitro which

9、 activates FGFR3 could relieve these effects.Key words：LPS;bone;osteoblast;FGFR3脂多糖(LPS)是膿毒癥中主要致病菌革蘭陰性菌的主要致病成分。LPS可引起多種臟器損傷、功能紊亂甚至衰竭。但骨骼在LPS引起的內毒素血癥中的變化和發生機制尚未完全闡明。我們在前期的研究中利用全基因組基因芯片掃描發現，LPS注射4小時后小鼠骨組織中成纖維生長因子受體3(FGFR3)表達顯著下調。有研究發現成年期FGFR3敲除小鼠骨質減少，并且體外培養的骨髓間充質細胞向成骨分化增強1。這提示FGFR3可負性調節成骨細胞的分化。但有文章發現在

10、細胞培養實驗中LPS抑制成骨細胞的分化2。那么LPS引起的FGFR3表達下降是否為機體的代償反應?本實驗將通過在動物、細胞水平增強FGFR3信號通路后檢測LPS刺激下成骨細胞分化的變化，以初步明確FGFR3信號通路在骨組織對LPS反應中的作用，為進一步闡明骨組織在炎癥反應中的變化奠定基礎。 材料與方法1 動物分組8周齡雄性C57小鼠和Ach小鼠各6只，分為LPS組和生理鹽水(NS)對照組，每組3只。LPS 15mg/kg (Sigma)或等量生理鹽水腹腔注射4小時后取右側全長脛骨，剔除肌肉、軟組織后液氮保存備用。2 細胞培養前成骨細胞系MC3T3E1(購自北京協和細胞庫)以含10%FBS(GI

11、BCO)的MEM(GIBCO)培養至融合后，以LPS 100ng/ml(sigma)、10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(BD)、LPS100ng/ml+bFGF 10ng/ml分別處理細胞4小時后搜集細胞備用。另取融合細胞用成骨誘導液培養：含50g/ml維生素C (sigma)、10mmol/L 磷酸甘油鈉(sigma)、100nmol/L地塞米松(sigma) 的完全培養基。以100ng/ml LPS、bFGF10ng/ml、LPS100ng+bFGF10ng/ml分別處理7天后搜集細胞備用。每組實驗重復2次，相同培養條件下以不加任何處理因素的細胞作為空白對照。3 定量聚合酶

12、鏈式反應(PCR)將相應時間點所取的上述脛骨組織和培養細胞以Trizol法提取總RNA。紫外分光光度儀測取RNA濃度，取1g總RNA為模板,參照逆轉錄試劑盒(Exscript,TAKARA)的說明書進行逆轉錄反應。cyclophilin A、白細胞介素6(IL6)、腫瘤壞死因子(TNF)、骨鈣素(OC)引物由上海生工生物工程公司合成(表1)。PCR反應體系配制及擴增條件設置參照定量PCR反應試劑盒說明書進行(SYBR Primer Ex Taq kit,TAKARA)。最后，由定量PCR儀(Mx3000P)自動給出c(t)值和目的基因的相對含量。4 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測參照ALP活性檢

13、測試劑盒(sigma)進行。成骨誘導7天細胞以裂解液：10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸(TrisHCl)，2mM氯化鎂，0.05% Triton X100(pH8.2)裂解后吸取30l上清加入至300l ALP活性測定液中，顛倒混勻后在37反應30分鐘，加入1ml 0.1N的NaOH中止反應，測定405nm的吸光值，以0.4N的HCl作對照。同時吸取30l上清加入至70l生理鹽水中，然后加入1ml BCA工作液，混勻后37反應30分鐘，測定562nm的吸光值，以100l生理鹽水作對照。每個樣品取其OD405/OD562的比值做統計分析。5 統計分析使用SPSS10.0統計軟件，采用OneWay ANOVA Tukey法比較組間差異，以P0.05為差異顯著。表1 定量PCR引物序列結 果1 FGFR3在