1、小鼠OCILrP2基因的克隆、 原核表達及抗血清的制備                    作者：靳迪  饒恩于 李景鵬 趙勇【關鍵詞】  小鼠OCILrP2;,原核表達;,抗OCILrP2抗血清摘 要  目的: 在原核系統中表達破骨細胞抑制凝集素家族成員之一OCILrP2基因,   并制備大鼠抗OCILrP2的抗血清。方法: 應用RTPCR從小鼠脾細胞中

2、克隆的部分OCILrP2 cDNA, 構建重組表達載體pET28aOCILrP2, 并轉化大腸桿菌BL21(DE3), 以IPTG誘導表達HisOCILrP2融合蛋白。以表達產物免疫SD大鼠, 制備大鼠抗OCILrP2的抗血清。采用Western blot測定其效價和特異性。結果: RTPCR法擴增出235 bp的OCILrP2基因, 其cDNA序列與GenBank中登錄的序列一致。以構建的重組質粒pET28aOCILrP2轉化大腸桿菌獲得目的蛋白的高表達。以表達的HisOCILrP2融合蛋白免疫大鼠獲得抗小鼠OCILrP2的抗血清。Western blot分析表明, 該抗血清均可與原核表達的

3、HisOCILrP2融合蛋白和真核表達的OCILrP2Ig融合蛋白特異性結合; 抗血清的效價為12000。結論: 在原核細胞中表達了小鼠的OCILrP2蛋白, 制備了大鼠抗小鼠OCILrP2的抗血清, 為進一步研究OCILrP2的生物學功能奠定了基礎。關鍵詞小鼠OCILrP2; 原核表達; 抗OCILrP2抗血清    破骨細胞抑制凝集素相關蛋白2（osteoclast inhibitory lectinrelated protein 2, OCILrP2）是破骨細胞抑制凝集素（OCIL）家族的成員之一, 屬于型跨膜糖蛋白, 具有1個較小的胞內區, 胞外區含有1個

4、C型凝集素結構域。小鼠OCILrP2基因位于6號染色體的NK基因復合體內。此復合體存在很多C型凝集素相關基因, 包括CD69、 NKG2家族及Ly49家族及NKRP1家族等。OCIL家族包括OCIL(Clrb)、 OCILrP1(Clrd)和OCILrP2(Clrg)3個基因, 其胞外區具有很高的同源性(約80%)1。OCILrP2主要在免疫系統中表達, 其中在B細胞和樹突狀細胞（DC）中呈高表達; 在未活化的CD4+和CD8+ T細胞中有微量表達, 但T細胞活化后, 其表達上調。最近發現, OCILrP2為NK細胞受體蛋白1（NKRP1）家族成員中NKRP1F的配體2。研究表明, OCILr

5、P2也可作為T細胞的共刺激分子, 在T細胞的活化過程中起作用3, 4。因此, 需要進一步研究OCILrP2在T細胞中的作用機制, 在B細胞、 DC中可能的功能, 以及其與NKRP1F相結合后對NK細胞功能的影響。本研究中用RTPCR克隆并在原核細胞中表達OCILrP2基因, 以表達的蛋白為免疫原制備大鼠抗OCILrP2的抗血清, 為進一步研究OCILrP2的功能提供了重要的試劑。1  材料和方法1.1  材料  Trizol試劑為Invitrogen公司產品。RTPCR試劑盒、 EcoR、 Xho和T4 DNA連接酶均為TaKaRa公司產品。質粒提取試劑盒、 DN

6、A膠回收試劑盒為博大泰克公司產品。弗氏完全與不完全佐劑購自欣經科公司。HRP化學發光底物為Pierce公司產品。HRP標記的羊抗大鼠IgG為Sigma公司產品。蛋白marker購自華美公司。DNA marker購自鼎國公司。C57/B6小鼠及SD大鼠購自維通利華公司。原核表達載體pET28a及E.coli BL21（DE3）由本實驗室保存。1.2  方法1.2.1  小鼠OCILrP2基因的克隆及重組表達載體的構建  以C57/B6小鼠脾細胞中提取的總RNA為模板, 用Oligo4進行逆轉錄反應合成cDNA第1條鏈, 再以上游引物（P1）5AAAGAATTCTGG

7、AAGTGGACAAACAACAC3（含EcoR酶切位點）和下游引物（P2）5AATCTCGAGGACCATAGGGGAAAAAGTAG3（含Xho酶切位點）進行, PCR擴增OcilrP2的部分cDNA。回收PCR產物（約為250 bp）, 用EcoR和Xho雙酶切后, 連接到表達質粒pET28a中的EcoR和Xho位點之間, 構建重組質粒pET28aOcilrP2。以重組質粒經轉化大腸桿菌BL21（DE3）后, 提取重組質粒, 經EcoR和Xho雙酶切鑒定后, 送上海博亞公司測序。1.2.2  重組HisOCILrP2融合蛋白的誘導表達  在3 mL含卡那霉素的LB培養

8、基中, 接種轉化菌鑒定正確的單個菌落, 于37振蕩培養10 h, 再按1100的體積接種于10 mL含卡那霉素的YT培養基中, 于37、 搖菌培養至A600=0.60.8。加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L, 于37誘導8 h。收集菌體, 用PBS混懸后, 進行超聲裂解, 離心裂解液, 收集上清和沉淀（沉淀用PBS混懸）。將上清和沉淀均加蛋白上樣緩沖液煮沸5 min, 以未經IPTG誘導的轉化菌作為對照, 進行SDSPAGE。百事通 1.2.3  大鼠抗小鼠OCILrP2蛋白抗血清的制備  SDSPAGE后, 切取含有HisOCILrP2融合蛋白的凝膠條。將此膠條于

9、PBS中研碎后免疫SD大鼠, 初次免疫用弗氏完全佐劑, 抗原量約為200     g/只, 于腹線兩側皮下多點注射。3周后, 加強免疫, 抗原量同首次, 加弗氏不完全佐劑, 以后每隔2周加強免疫1次, 共免疫4次。最后1次免疫后7 d, 由頸動脈取血, 分離血清凍存于-20中。1.2.4  抗血清效價及特異性的Western blot 檢測  將分離的抗血清按1200、 1500、 11000、 12000系列稀釋后, 進行Western blot檢測抗血清的效價。將菌體總蛋白和本實驗室制備的真核表達的OCILrP2Ig融合蛋白同時進

10、行SDSPAGE后, 將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上。依次滴加系列稀釋的大鼠抗血清（過夜孵育, 洗滌）及12500 HRP標記的羊抗大鼠IgG(孵育2 h, 洗滌), 最后滴加HRP化學發光底物, 用ChemilmagerTM4400凝膠成像儀檢測發光信號。2  結果2.1  小鼠OCILrP2基因的克隆  以P1和P2為引物, 以小鼠脾細胞中提取的總RNA為模板, 經RTPCR擴增出約250 bp的特異性基因片段, 大小同預計結果相符（圖1）。 圖1  OCILrP2基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析略2.2  重組表達載體pET28

11、aOCILrP2的構建  構建的pET28aOCILrP2經EcoR I和Xho I雙酶切后, 可得到1條約為250 bp的片段（圖2）。DNA測序結果與GenBank中登錄的序列完全一致。 圖2  重組質粒pET28aOCILrP2的酶切鑒定略2.3  HisOCILrP2融合蛋白的表達及鑒定  將含重組質粒的菌株經誘導和未經誘導8 h后, 收獲菌體, 進行SDSPAGE分析。誘導菌出現相對分子質量（Mr）約為10000的1條帶, 未誘導菌中沒有此條帶（圖3）。采用抗HisTag的抗體進行Western blot檢測, 在相當于目的蛋白的Mr

12、處出現1條特異性的帶（結果未顯示）。 圖3  IPTG誘導HisOCILrP2融合蛋白表達的SDSPAGE分析略2.4  大鼠抗OCILrP2抗血清的制備與鑒定  大鼠經4次免疫后, 用Western blot檢測抗血清的效價和特異性。結果顯示, 在相當于HisOCILrP2融合蛋白的Mr處出現1條特異性的帶; 而未免疫大鼠的血清則不與目的蛋白結合。抗血清的效價達12000。進一步用本實驗室制備的真核表達的OCILrP2Ig融合蛋白進行Western blot檢測, 抗血清也能與真核表達的OCILrP2Ig融合蛋白特異性結合, 表明我們所制備的抗血清有較

13、高的活性和特異性（圖4）。 圖4  OCILrP2抗血清的效價和Western blot的特異性分析略3  討論OCILrP2基因編碼221個氨基酸, 包括141個氨基酸的胞外區、 21個氨基酸的跨膜區以及59個氨基酸的胞內區, 其中胞外區含有由113個氨基酸殘基構成的C型凝集素結構域。OCILrP2可能在維持T細胞反應和記憶功能中起作用3, 4。OCILrP2與其配體NKRP1F的基因都在NKC區內, 這種受體與其配體屬于同一超家族, 并且緊密連鎖是極為罕見的, 可能有利于受體和其相應配體的共遺傳, 并提示NKRP1和OCIL家族可能在免疫系統中具有重要的功能2

14、, 5。為了進一步研究OCILrP2的功能, 我們通過比較小鼠OCIL家族的3個成員（mOCIL、 mOCILrp1和mOCILrp2）的同源性, 克隆了OCILrP2基因胞外區同源性低的區域, 構建了重組表達載體pET28aOCILrP2, 并在大腸桿菌中表達了融合蛋白HisOcilrp2。用表達的蛋白免疫SD大鼠獲得了能與OCILrP2特異性結合的抗血清, 為進一步研究OCILrP2的功能提供了工具。參考文獻:1 Zhou H, Kartsogiannis V, Quinn JM, et al. Osteoclast inhibitory lectin, a family of new o

15、steoclast inhibitorsJ. J Biol Chem, 2002, 277: 48808-48815.2 Carlyle JR, Jamieson AM, Gasser S, et al. Missing selfrecognition of Ocil/Clrb by inhibitory NKRP1 natural killer cell receptorsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 3527-3532.3 Tian W, Nunez R, Cheng S, et al. Ctype lectin OCILRP2/Clrg and its ligand NKRP1f costimulate T cell proliferation and IL2 productionJ. Cell Immunol, 2005, 234