1、懸浮細胞傳代及細胞計數一、 細胞傳代 實驗目的： 掌握懸浮細胞傳代技術。進一步掌握細胞培養的操作技術。 實驗原理：培養細胞生長一定時間后， 需分離再培養， 否則細胞因生存空間不夠， 細胞密度 過大，致營養不足而引起細胞衰老、 停止生長甚至死亡。 為了維持細胞的存活和 生長，必須進行再培養，即將原培養瓶內細胞分離、稀釋、接種到新培養瓶內繼 續擴大培養。實驗用品：（一）儀器凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4C、-20 C、-70 C）、倒置相差顯微鏡、培養箱；（二）玻璃器皿 吸管（彎頭、直頭）、培養瓶、廢液缸、（三）塑料器皿 吸頭、槍頭、膠塞、移液管、 15ml 離心管、離心管架（四）其他物

2、品 微量加樣槍、計數板、記號筆、移液槍（五）試劑1640 培養液、 PBS 操作步驟：1. 準備： 打開培養液， PBS； 取出離心管，擰開管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸 頭，插入離心管備用。2. 從培養箱內取出細胞，放在顯微鏡下觀察其生長狀態、密度。3. 首先觀察培養板孔中培養液量。 用吸管分別吸出兩個孔中的細胞連同培養液， 轉入離心管中。再另取一只吸管吸取 PBS放入培養板孔中，輕輕吹打孔壁， 吸出轉入離心管。4. 離心，設置離心機 1000轉/分， 4-5 分鐘。5. 取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。吸取培養液約7ML放入離心管，輕輕吹打細胞，使之均勻懸浮。6. 吸

3、取1ML細胞懸液1ML轉入EP管中，備計數用。7. 其余的細胞分別放入六個孔中，每孔約 1ML。8. 吸取培養液加入板孔中至 1/3 孔容量。9. 鏡下觀察細胞是否分布均勻，放入培養箱培養。 二、細胞計數及生長曲線測定培養細胞生長過程：潛伏期-指數增生期一停滯期潛伏期 (latent phase) 細胞接種后,先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期 .此時,細胞質回縮, 胞 體呈圓球形 .然后細胞貼附于載體表面 ,稱貼壁,懸浮期結束 . 細胞貼壁速度與細 胞種類, 培養基成分 ,載體的理化性質等密切相關。一般情況下，原代培養細胞 貼壁速度慢 ,可達1 0-24 小時或更多 , 而傳代細胞系貼壁

4、速度快 , 通常1 0-30 分 鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期 . 原代培 養細胞潛伏期長， 約24-96 小時或更長 , 連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短， 僅需 6-24 小時。(2) 指數增生期 (logarithmic growth phase)這是細胞增殖最旺盛的階段， 分裂相細胞增多。 指數增生期細胞分裂相數量可作 為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數( Mitotic index, MI)表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。一般細胞的分裂指 數介于0.1%-0.5%，原代細胞分裂指數較低，而連續細胞和腫瘤細胞分裂相指數

5、 可高達 35。指數增生期的細胞活力最好時期，是進行各種實驗最佳時期， 也是凍存細胞的最好時機。 在接種細胞數量適宜情況下， 指數增生期持續 35 天 后，隨著細胞數量不斷增多、生長空間減少，最后細胞相互接觸匯合成片。正常 細胞相互接觸后能抑制細胞運動，這種現象稱接觸抑制現象 (contact inhibition) 。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現象，能繼續移動和增殖，導致細胞 向三維空間擴展，使細胞發生堆積(piled up)。細胞接觸匯合成片后，雖然發 生接觸抑制，但只要營養充分， 細胞仍能進行增殖分裂， 因此細胞數仍然在增多。 但是，當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多

6、時，細胞 因營養枯竭和代謝產物的影響，導致細胞分裂停止，這種現象稱密度抑制現象 ( Density Inhibition )。( 3)停滯期 (Stagnate phase)細胞數量達到飽和密度后， 如不及時進行傳代， 細胞就會停止增殖， 進入停止期。 此時細胞數持平，故也稱平臺期( Plateau phase )。停滯期細胞雖不增殖，但 仍有代謝活動。如不進行分離傳代， 細胞會因培養液中營養耗盡、 代謝產物積聚、 pH 下降等因素中毒，出現形態改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發生死亡，因 此，應及時傳代。實驗目的：1. 能獨立的進行細胞技術，會繪制生長曲線，了解細胞生長的發育特性。2. 學習在

7、科研中如何應用生長曲線實驗原理： 生長曲線的測定 (計數法) 是測定細胞絕對生長數的常用方法， 也是判定細胞活 力的重要指標， 為培養細胞生物學特性的基本參數之一。 一般細胞傳代之后， 經 過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數生長期。在細胞達到飽和密度后， 停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中的細胞數目的動態變化， 需連續對細胞進行計數， 通常 計數 7 天。為精確起見， 一般每次計數三瓶細胞并取平均值。 典型的生長曲線可 分為生長緩慢的潛伏期， 成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個部分。 以存活細胞數 對培養時間做圖，即生長曲線。生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細胞生長

8、的影響。一般在對數期的1/3-1/2 處加藥。細胞技術的時間和次數依實驗目的而定。另外，測定生長曲線的常用方法還有 MTT法。計數板原理： 當待測細胞懸液中細胞均勻分布時， 通過測定一定體積懸液中的細 胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。操作步驟 ：1. 將計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板，放在鏡下觀察。2. 制備細胞懸液： 細胞從培養板孔轉移到離心管， 離心 1000轉 4-5 分鐘， 棄去 上清，加入PBS至一定體積(1ML。3. 將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間，靜置3min,注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。4. 計算

9、板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按公式計算：細胞數/mL=四大格細胞總數/4 x 104說明：公式中除以 4，因為計數了 4 個大格的細胞數。公式中乘以 104因為計數板中每一個大格的體積為：1.0mm (長)x 1.0mm(寬)x 0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3(注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團， 應按單個細胞計算， 若細胞團10%以上，說明分散不好，需重新稀釋制備細胞懸液)臺盼蘭染色操作步驟：1、制備細胞懸液，放入EP管中。2、以 1：1 的比例加入 0.4%臺盼蘭染液，染色 2 一 3 分鐘。3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。4、

10、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計算細胞活力。凍存與復蘇一、哺乳動物細胞冷凍保存實驗目的：( 1 )保存種子細胞，以便隨時取用。這是保存細胞的最主要目的。( 2)減少細胞被微生物污染的危險性。( 3)減少細胞之間交叉污染的危險性。( 4)減少細胞因傳代培養而引起的遺傳變異和形態改變。( 5)避免有限細胞系出現衰老或惡性轉化。實驗原理：細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。

11、復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內 即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成 損傷。實驗用品：（一）儀器凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4C、-20 C、-70 C）、倒置相差顯微鏡、培養箱、液氮冰箱。（二）玻璃器皿吸管（彎頭、直頭）、培養瓶、玻璃瓶（ 250ml 、 100ml ）、廢液缸；（三）塑料器皿吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml ）、15ml離心管、凍存管（12ml）（四）其他物品 微量加樣槍、紅血球計數板、記號筆、移液槍。（五）試劑1640培養液、DMSQ分析純）K562細胞，慢性粒細胞白血病細胞系中的一種。操作步驟：

12、1. 準備：打開培養液， PBS； 取出離心管，擰開管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸 頭，插入離心管備用。2. 配制凍存液：吸取9ML培養液放入離心管，用移液槍吸取 1MLDMS溶液，逐 滴緩慢加入離心管中。最好把離心管插在冰中。2. 從培養箱內取出細胞，放在顯微鏡下觀察其生長狀態、密度。3. 吸出 1 個孔中的細胞連同培養液，轉入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培養板孔中，輕輕吹打孔壁，吸出轉入離心管。4. 離心，設置離心機 1000 轉 4-5 分鐘。取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液 缸。輕輕吸出余下的培養液，注意勿吸出細胞沉淀。5. 吸取1ML配制好的凍存液加入離

13、心管，與細胞混勻后，轉入凍存管。6. 標注： 標明細胞種類、凍存日期，凍存人7. 在4C冰箱中放置30分鐘；然后轉入-20 C,放置30分鐘；然后再轉入-80 C 放置 1618 小時（或過夜）；最后放入液氮中長期保存。有條件的地方， 可用凍存盒。注意事項：（1）凍存過程需緩慢（ 2）凍存細胞必須處在對數生長期,活力大于 90,無微生物污染。（3）細胞濃度控制在：1 X 107-5X 107/ml。（4）使用合適的細胞冷凍保護劑,以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前，最常用的冷凍保護劑是DMSO二甲基亞砜），使用終濃度為510%。但是， 有些細胞系不能用DMS作為冷凍保護劑，如人白血病細胞

14、系HL-60。因為，DMSC能 誘導HL-60細胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護劑，如甘油（glycele ）, 羥乙基淀粉等。（5）DMSO稀釋時會釋放大量熱量。因此，DMSC不能直接加到細胞液中，必須 事先配制。細胞復蘇操作步驟：（一）準備工作1、37C水浴2、準備一個內裝 5-10 ml 細胞完全培養液離心管 。（二）復蘇1、帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，迅速放入 37C水浴中，手持 凍存管不斷搖動。 觀察完全解凍后移入超凈臺。 冷凍管在水浴中解凍時， 液面不 可超過凍存管蓋面，否則，易發生污染。2、打開凍存管，迅速將細胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻。3、lOOOrpm離

15、心5 min，棄去上清液。4、沉淀中加入適當培養基，37C常規培養，第二天觀察生長情況。注意事項：1. 解凍操作過程動作要輕。由于冷凍保存過的細胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，而且動作要輕2. 解凍時務必注意安全，預防冷凍管爆裂。，要帶手套，用鑷子將細胞冷凍管 從液氮中取出，切不可直接用手，以免凍傷。僅供個人用于學習、研究；不得用于商業用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommer