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文檔簡介

1、應用固相合成法合成下列堿基順序的DNA: 5-GCCTAACGTAAC-3。DNA化學合成時由3端向5進行。合成原理步驟如下:1.脫保護基:用三氯乙酸脫去預先連接在CPG上的核苷酸的保護基團DMT(二甲氧基三苯甲基,獲得游離的5-羥基端,以供下一步合成反應。2.活化:將質子化的核苷3-亞磷酰胺單體與四氮唑活化劑混合進入合成柱,形成亞磷酸酰胺四唑活性中間體(其5端仍受DMT保護,3端被活化。3.連接:二步中活化得到的中間體遇到一步中脫保護基的核苷酸,與核苷酸的5-羥基發生親核反應,縮合并且脫去四唑,此時合成的寡糖核苷酸鏈向前延長一個堿基。4.氧化:縮合反應時核苷酸單體是通過亞磷酸酯鍵與連接在CP

2、G上的寡糖核苷連接,而亞磷酸酯鍵不穩定、易被酸、堿水解,此時常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酸酰胺轉化為磷酸三脂,得到穩定的寡糖核苷酸。經過上述幾個步驟后,一個脫氧核苷酸就被連接到CPG的核苷酸上,再采取上述同樣的步驟,即可得到一DNA片段樣品。最后對其進行切割和脫保護基。具體則是用苯硫酚除去5-OH上的保護劑DMT,用濃氫氧化銨將DNA片段與固相樹脂斷開,使DNA得以洗脫下來。再用濃氫氧化銨在加熱條件下使堿基上的保護劑除去,最后除去氫氧化銨,在真空中抽干。DNA純化分離:利用HPLC或者PAGE對得到的粗品進行純化分離,得到所需的DNA分子。DNA序列鑒定:檢定D N A 片段的順序的方法主要有兩

3、種: (1wandering SPot方法,主要適用于適用于寡核苷長度在20個堿基以下的片段;(2化學裂解法,該法核苷酸堿基順序從凝膠的放射自顯影圖譜上直接讀出,但對于合成產物中少量的不純物是檢測不出來的;具體步驟:各種基團的保護方分別如下圖所示:(1戊糖的保護 (2堿基的保護 在本題中保護后的堿基A、C、G分別簡記為Ba、Bc、Bg、Bt。因為T無需保護,為書寫方便簡記為Bt。(3磷酸酯基的保護:具體合成步驟如下: 如此不斷重復,最后得到一條DNA分子的長鏈,其結構如下: 得到粗產物后再利用電泳或者HPCL技術加以分離,回收片段最長的。DNA的鑒定經分離純化后的DNA寡核苷酸片段,應對其質量(包括長度和核苷酸順序進行檢定。檢定DNA片段的順序的方法:采用wandering SPot方法,適用于寡核苷酸長度在20個堿基以下的片段。寡核苷酸片段5一端經一32P-ATP用T4多核苷酸激酶標記后,經蛇毒磷酸二醋酶進行部分水解,標記混合物于pH=3.5的條件下在醋酸纖維紙上進行電泳,然后在DEAE一纖維素板上進行同系層析,寡核苷酸的順序通過這一標記消化產物的特定遷移率來測定。此方法的好處在于不僅可測出寡核苷酸的順序,也可以檢出不純物的污染。參考文獻:1.生物化學教材,古練權,高等教育出版社2.DNA的化學合成及其應用,靜

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