1、免疫細(xì)胞的分離和保存技術(shù)用體外方法對機(jī)體各種具有免疫反應(yīng)的細(xì)胞分別作鑒定、計(jì)數(shù)和功能測定，是觀察機(jī)體免疫狀態(tài)的一種重要手段。 為此，須將各種參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞從血液或臟器中分離出來。 參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。由于檢測的目的和方法有同， 分離細(xì)胞的需求和技術(shù)也異。 有的僅需分離白細(xì)胞，有的則需分離單個核細(xì)胞（ mononuclearcell），其中含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（ monocyte），有的則需分離 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞以及其亞群。分離細(xì)胞選用的方法應(yīng)力求簡便可行，并能獲得高純度、高獲得率、高活力的細(xì)胞。現(xiàn)用分離細(xì)胞群的原則， 一是根據(jù)各類細(xì)胞的大小、

2、沉降率、粘附和吞噬能力加以組分，另一則按照各類細(xì)胞的表面標(biāo)志， 包括細(xì)胞表面的抗原和受體加以選擇性分離。一、白細(xì)胞的分離（一）血液中紅細(xì)胞與白細(xì)胞比例約 600 1000:1，兩者的比重不同其沉降速度亦異，通常用兩種方法加以分離。本法是利用血細(xì)胞自然沉降率的分離法， 采集血液后應(yīng)及時抗凝， 通常選用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶， 從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而防止血液凝固。操作原則是將含抗凝血的試管直立靜置室溫 30 60min 后，血液分成明顯三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細(xì)胞，緊貼紅細(xì)胞層上面的灰白層為白細(xì)胞， 輕輕吸取即得富含白細(xì)胞的細(xì)胞群， 離心洗滌后加入少量蒸餾水或

3、含氯化銨的 Gey 溶液，經(jīng)短時間的低滲處理，使紅細(xì)胞裂解，經(jīng)過反復(fù)洗滌可得純度較高的白細(xì)胞懸液。（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（ polyvinylpyrolidone ，PVP）等使紅細(xì)胞凝集成串，加速紅細(xì)胞沉降，使之與白細(xì)胞分離。本法的細(xì)胞獲得率比自然沉降法高。二、外周血單個核細(xì)胞的分離外周血中單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090 左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為 1.0751.090，血小板為 1.0301.035。為此利用一種密度介于1.0751.092 之間而近

4、于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。 常用的分層液有 Ficoll 和 Percoll 兩種。（一） Ficoll 分層液法主要用于分離外周血中的單個核細(xì)胞， 是一種單次密度梯度離心分離法。 聚蔗糖泛影葡胺是一種較理想的細(xì)胞分層液， 其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為 Ficoll ），分子量為 40kD，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點(diǎn)。高濃度的 Ficoll 溶液粘性高，易使細(xì)胞聚集，故通常使用 60g/L 的低濃度溶液，密度為 1.020，添加比重為 1.200 的泛影葡胺（ urografin）以增加密度

5、。國外常用商品 Isopaque或 Hypaque，故又稱 Ficoll-Hypaque 分層液，將適量 340g/L 泛影葡胺加入 Ficoll 溶液中即可配制成密度合適分層液。 分離人外周淋巴細(xì)胞以密度為 1.077 ±0.001 的分層液最佳， 因?yàn)槿说募t細(xì)胞密度為 1.093，粒細(xì)胞密度為1.092，單個核細(xì)胞在 1.0761.090 之間。而不同動物血中的單個核細(xì)胞對分離液的密度要求各不相同， 如小鼠為 1.088，馬為 1.090。分離時先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以 Hanks 液或 PBS 液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個清晰的界面。 水

6、平式離心后， 離心管中會出現(xiàn)幾個不同層次的液體和細(xì)胞帶（圖 20-1）。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液， 同時因紅細(xì)胞遇到 Ficoll 而凝集成串錢狀而沉積于管底。 血小板則因密度小而懸浮于血漿中， 唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中， 呈白膜狀，吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸。本法分離單個核細(xì)胞純度可達(dá) 95，淋巴細(xì)胞約占 90 95，細(xì)胞獲得率可達(dá) 80以上，其高低與室溫有關(guān)，超過 25時會影響細(xì)胞獲得率。（二） Percoll 分層液法這是一種連續(xù)密度梯度離心分離法。Percoll 是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細(xì)胞無毒性。利用 Percoll

7、 液經(jīng)高速離心后形成一個連續(xù)密度梯度的原理，將密度不等的細(xì)胞分離純化。用 Percoll 原液 (密度 1.135)與約等量雙離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液均勻混合， 高速離心后，使分層液形成一個從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度， 再將已制備的單個核細(xì)胞懸液輕輕疊加在液面上，低速離心后，便得四個細(xì)胞層。表層為死細(xì)胞殘片和血小板，底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，中間有兩層，上層富含單個核細(xì)胞 (75 )，下層富含淋巴細(xì)胞(98)(圖 -2)。該法是純化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的一各較好的方法，但操作流程較長，手續(xù)較多。圖-2 連續(xù)密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞中各細(xì)胞成分的分布示意圖三、淋巴細(xì)胞及其亞群的分離為研究免

8、疫細(xì)胞的功能，常需高純度的淋巴細(xì)胞或其亞群，分離方法介紹如下。（一）、純淋巴細(xì)胞群的采集通常利用單核細(xì)胞在 37和 Ca2+存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性， 據(jù)此建立許多從單個核細(xì)胞懸液中去除單核細(xì)胞的方法，藉以獲得高純度的淋巴細(xì)胞群。（1）粘附貼壁法將已制備的單個核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37溫箱靜置 1h 左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。因B 細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B 細(xì)胞有所損失。（2）吸附柱過濾法將單個核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃

9、纖維或葡聚糖凝膠 SephadexG10 的柱層中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中， 從柱上洗脫下來的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞。此法簡單易行，對細(xì)胞極少損害。（3）磁鐵吸引法利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性， 在單個核細(xì)胞懸液中加直徑為 3m的羰基鐵顆粒，置 37溫箱內(nèi)短時旋轉(zhuǎn)搖動，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞。（二）、淋巴細(xì)胞亞群的分離分離相當(dāng)純化的淋巴細(xì)胞亞群是細(xì)胞免疫檢驗(yàn)的基本技術(shù)。其原則是根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化。 凡根據(jù)細(xì)胞的特性和標(biāo)志選擇純化所需細(xì)胞的方法是陽性選擇法； 而選擇性去除不要的細(xì)胞， 僅留下所需的

10、細(xì)胞是為陰性選擇。常用以下幾種方法：（1）E 花環(huán)沉降法本法是將淋巴細(xì)胞與一定比例的綿羊紅細(xì)胞混合，待淋巴細(xì)胞形成E 花環(huán)后，繼用淋巴細(xì)胞分層液分離細(xì)胞。浮懸在分層界面而不形成E 花環(huán)的群則富含 B 細(xì)胞，而沉降在管底的形成 E 花環(huán)的細(xì)胞用低滲法處理，使圍繞細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞快速裂解，則獲得純的 T 細(xì)胞。（2）尼龍毛分離法本法利用 B 細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性， 可將 T 和 B 細(xì)胞分開。操作原則是取松散而經(jīng)過處理的尼龍毛（聚酰胺纖維），均勻充填在內(nèi)徑 56nm 的聚乙烯塑料管（飲料管即可）內(nèi)，經(jīng) Hanks 液浸透保溫，將單個核細(xì)胞懸液加入柱內(nèi)，放 37 溫箱靜置

11、 12h。用預(yù)溫的含 10 20小牛血清培養(yǎng)液灌洗，洗脫液內(nèi)含有非粘附的 T 細(xì)胞，重復(fù)灌洗幾次以除去管內(nèi)殘留的 T細(xì)胞。再用冷或溫培養(yǎng)液邊沖邊洗邊擠壓塑料管，此時洗脫液內(nèi)富含 B 細(xì)胞。如此得到的 T 細(xì)胞純度在 90以上， B 細(xì)胞純度可達(dá) 80。（3）親和板結(jié)合分離法利用親和層析法分離淋巴細(xì)胞亞群， 其原理是各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液， 凡抗原陽性的細(xì)胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲取（圖 -3）。同樣若用特異性抗原交聯(lián)在塑料板上， 則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。 淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體接觸， 可引起

12、細(xì)胞激活， 因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時，本法更適用。如要分離 CD4+或 CD8+細(xì)胞，則可用抗 CD4 或 CD8 單克隆抗體吸附。用抗 Ig 抗體則可分離 B 細(xì)胞。同樣，用活化的 C3 包被，可分離出有 C3 受體的細(xì)胞。圖-3 親和分離法圖解（ 4）熒光激活細(xì)胞分離儀分離法熒光激活細(xì)胞分離儀（ fluorescenceactivatedcellsorter，F(xiàn)ACS）主要由 4 部分組成：細(xì)胞流動系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)， 激光系統(tǒng)， 檢測與訊號處理系統(tǒng)，細(xì)胞分選系統(tǒng)。其主要原理是細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行， 逐個流經(jīng)檢測區(qū)進(jìn)行測定。 當(dāng)細(xì)胞從流動室噴嘴

13、處流出時， 超聲振蕩攪動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴（ 40000 個/s），每小滴內(nèi)最多含一個細(xì)胞（其中只有百分之幾的液滴中含細(xì)胞） ，細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞的類型。如識別的是預(yù)計(jì)所需的細(xì)胞時（如 T 細(xì)胞、 B 細(xì)胞要其亞群），在細(xì)胞樣品流斷裂成小滴時， 使液滴瞬即感應(yīng)陽電荷、 陰電荷或不帶電荷， 使所需的細(xì)胞在電場偏轉(zhuǎn)下進(jìn)入不同的收集管（圖-4）。用 FACS 分離細(xì)胞準(zhǔn)確快速，能保持細(xì)胞活力，并可在無菌條件下進(jìn)行，但儀器昂貴，極少用于常規(guī)，而多數(shù)僅作為研究的手段。圖 -4 熒光激活細(xì)胞分離儀簡圖四、吞噬細(xì)胞的分

14、離和收集人外周血中單核巨噬細(xì)胞可通過Pecoll 密度梯度分離法獲取，但數(shù)量較少，用血量多。用斑蝥敷貼法可從人體組織液中獲取較純的巨噬細(xì)胞，不需作進(jìn)一步體外分離，細(xì)胞量損失較少。該法是用濾紙蘸取10中藥斑蝥酒精浸出液，貼敷在臂內(nèi)側(cè)皮膚表面，4 5h 后皮膚局部充血， 48h 后局部形成水皰，吸取皰中的組織液， 內(nèi)含巨噬細(xì)胞。 但此法對病人皮膚有一定損傷，有時可引起局部感染，應(yīng)慎用。欲獲取小鼠、大鼠、豚鼠等小動物的巨噬細(xì)胞，可經(jīng)腹腔內(nèi)注入少許石蠟油， 34 天后沖洗出腹腔滲出液，所得細(xì)胞懸液中70 80為巨噬細(xì)胞。五、淋巴細(xì)胞的保存和活力測定（一）、分離細(xì)胞的保存在某些情況下，分離所得細(xì)胞需要加

15、以保存，否則活力迅速下降，甚至死亡。（1）短期保存技術(shù)將分離到的細(xì)胞用適量含10 20滅活小牛血清的Hanks、 Tc-199、RPMI1640 或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。所用培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用，并對細(xì)胞無毒性。通常置 4保存較好，可減低細(xì)胞代謝活動。要注意不要迅速改變細(xì)胞所處的溫度，以免造成細(xì)胞 “溫度 ”休克。（2）長期冷凍保存技術(shù)利用液氮深低溫（ 196）環(huán)境保存細(xì)胞，是當(dāng)前世界上通用的細(xì)胞長期保存技術(shù)。其原理在于深低溫環(huán)境可中斷細(xì)胞的代謝， 但在降溫過程由于冰晶的形成和滲透壓的改變均可導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和部分死亡， 所以在冷凍過程中一定要加用冷凍保護(hù)劑，常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（ dim

16、ethylsulfoxide ， DMSO ）。冷凍時的降溫速度和細(xì)胞解凍時的升溫速度對細(xì)胞活力的保存有很大影響。 條件合適時，凍存細(xì)胞一旦復(fù)蘇，恢復(fù) 37培養(yǎng)，其形態(tài)和代謝活動均可恢復(fù)正常。操作的原則是先對需凍存的細(xì)胞作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含10二甲亞砜的小牛血清配制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液， 分裝于凍存管內(nèi)， 速即放入降溫過渡站中， 避免二甲亞砜對細(xì)胞的損傷。 繼而進(jìn)行降溫冷凍， 目前常用兩步降溫法，即迅速降溫至一選擇好的臨界溫作為過渡站， 如 80低溫冰箱過夜，或在液氮罐液面以上的一層空間放置片刻，然后再放入液氮中。如需復(fù)蘇細(xì)胞，則需迅速解凍以恢復(fù)細(xì)胞的活力， 要求在 20s

17、 以內(nèi)完全融化。 將凍存管自液氮中取出，立即放入 40溫水中，融化后即從水中取出，吸出細(xì)胞懸液，加入 10 倍的培養(yǎng)液中混勻，繼而低速離心，盡快洗去保護(hù)劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力，然后置 37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。（二）、細(xì)胞活力測定細(xì)胞活力常用百分比表示， 活力的大小對試驗(yàn)結(jié)果有很大影響。 細(xì)胞活力的測定有許多方法，最簡便常用的方法是臺盼藍(lán)（ trypanblue）染色法。臺盼藍(lán)又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料， 這種染料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜， 故活細(xì)胞不著色， 但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加， 可使染料通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán)色。免疫檢測試劑中常用的防腐劑有硫柳汞、疊氮鈉、抗生素等。1. 疊氮鈉是 HRP 的抑制劑，凡是和 HRP 接觸的試劑，一定不能用；2. 硫柳汞在 ELISA 試劑中可普遍使用，但因其有毒，較少使用；3. 市面許多試劑盒產(chǎn)品，用抗生素做防腐劑較多，如慶大。4. 如果試劑僅在實(shí)驗(yàn)室短期使用，其實(shí)并不需加防腐劑，常規(guī)試劑放4 度冰箱，抗體、酶等加甘油分裝凍存即可。5. 梅里埃生產(chǎn)的 HIV 診斷試劑中提到：對照血清的防腐用0.1g/L 硫酸慶大霉素和 0.2ml/L 肉桂醛。6.防污染可添加 0.02%的疊氮鈉，或 0.01%的硫柳