1、    轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1的表達(dá)與肺放射性 損傷關(guān)系研究        【摘要】目的研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF-1) 在正常肺組織放射損傷中的作用。方法采用免疫酶聯(lián)法（ELISAs）、免疫組化、蘇木素-伊紅（HE）染色和維多利亞藍(lán)（VB）染色等方法觀察血清和組織中TGF-1的表達(dá)與放射損傷的關(guān)系。結(jié)果照射后血清中TGF-1平均水平高于照射前，差異有顯著意義(P<0.05);不同劑量組血清TGF-1平均水平亦高于照射前，差異有顯著意義(P<0.05)。HE染色

2、各組照射區(qū)域均有急性炎癥改變,20Gy組最明顯；免疫組化TGF-1蛋白的表達(dá)和VB染色膠原纖維和彈力纖維的改變高劑量組和觀察期長(zhǎng)者明顯。結(jié)論TGF-1在正常肺組織放射性損傷中有非常重要的作用。【關(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1；放射損傷；肺 Relation between transforming growth factor-1 expressionand radiation injury of lungSUN Suping,JIN Yening,WEI Yi,et al. Department of Radiation Oncology, Changhai Hospital,Secondary Me

3、dical University,PLA,Shanghai 200433【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of transforming growth factor-1 (TGF-1) in radiation-induced injury of lung.MethodsELISAs,immuno-histochemical, HE ,anti-TGF-1 and VB stains were used to observe the relation between TGF-1 expression and radiation-induc

4、ed injury of lung.ResultsThe average serum TGF-1 level after radiation was higher than before radiation(P<0.05). The average serum TGF-1 level in different dose groups was also higher than before radiation (P<0.05). Acute inflammatory changes were more often seen in the HE group with the highe

5、st at 20Gy.Immuno-histochemical TGF-1 expression and changes in VB collagenous and elastic fibers were predominantly observed in the high dose groups and long survivors.ConclusionsTransforming growth factor-1(TGF-1),a biologic factor,plays a very important role in radiation induced injury of the nor

6、mal lung.【Key words】Transforming growth factor-1;Radiation injury;Lung轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(transforming growth factor-1，TGF-1)具有多種生物學(xué)功能,包括對(duì)正常組織的調(diào)節(jié)，對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制及對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制作用。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討TGF-1在血清及組織中的表達(dá)與正常兔肺組織放射損傷的關(guān)系,從生物學(xué)角度研究放射損傷的原因,以期指導(dǎo)放射治療方案的制定及并發(fā)癥的預(yù)防。1材料與方法1.1動(dòng)物：純種新西蘭白兔33只,體重3kg左右,由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。1.2分組：將

7、33只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為4個(gè)組,前3個(gè)組為照射組,每組9只,分別單次照射10，20，30Gy;第4組6只為空白對(duì)照組。1.3照射：用體積分?jǐn)?shù)為0.3的氨基甲酸乙醇按7501000mg/kg體重做腹腔麻醉。將麻醉好的實(shí)驗(yàn)兔前肢展開固定于塑料泡沫板的凹槽中,選取1只行胸部CT平掃,層厚為8mm,在治療計(jì)劃系統(tǒng)(TPS)下做計(jì)劃,使照射區(qū)域在90劑量曲線內(nèi)。模擬機(jī)下定位,照射野3cm×3cm,中心位于氣管分叉上1cm,包括上肺、氣管、食管、脊髓和部分心臟及大血管。采用加速器10MV-X線,水平等中心照射,劑量比11。1.4觀察與處死：照射后觀察肺、食管、脊髓損傷的臨床表現(xiàn)。照射后4周和12周各

8、劑量組分別隨機(jī)抽取1只實(shí)驗(yàn)兔行胸部CT掃描,觀察胸部照射區(qū)表現(xiàn)。照射組于4周開始每隔4周每組各處死2只實(shí)驗(yàn)兔,最后3只在18周時(shí)處死,觀察大體標(biāo)本肉眼改變及取材制片。對(duì)照組不做處理,同等條件飼養(yǎng),18周處死, 取材制片。1.5血清標(biāo)本的采集與測(cè)定(1)采集：照射組每組6只共18只實(shí)驗(yàn)兔在照射前、后1周分別采血2mL,全部實(shí)驗(yàn)兔共27只均在照射后2，4周分別于耳廓前或后靜脈穿刺抽血2mL,室溫下靜置34小時(shí),20002500r/min離心20分鐘,取血清0.5mL置于1.5mL聚丙二醇脂試管內(nèi),20冰箱內(nèi)保存待測(cè)。(2)測(cè)定：免疫酶聯(lián)法檢測(cè)(ELISAs)。TGF-1小鼠單抗試劑盒為Genzym

9、e公司產(chǎn)品,保存溫度為28,測(cè)定前試劑盒內(nèi)所有試劑均需達(dá)到室溫(1820),操作按說明書進(jìn)行。1.6取材固定與制片(1)取材固定：將實(shí)驗(yàn)兔固定于取材板上,股動(dòng)脈放血，胸正中切口,分離皮膚至肋側(cè),沿胸骨兩側(cè)剪斷肋骨,切除胸骨，暴露胸腔,將心臟、肺、氣管、食管整體取出,截取胸段脊髓,切取心臟、肺、氣管、食管、脊髓照射區(qū)域組織塊,固定于10福爾馬林中48小時(shí)。(2)制片：石蠟包埋連續(xù)切片,片厚5m，蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變;免疫組織化學(xué)檢測(cè):抗TGF-1小鼠單抗和羊抗鼠二抗為DAKO公司產(chǎn)品，操作按說明書加以改進(jìn),觀察TGF-1的表達(dá),棕黃色顆粒為陽性結(jié)果;維多利亞藍(lán)(VB)

10、染色,光鏡下觀察膠原纖維和彈力纖維的改變, 膠原纖維呈紅色, 彈力纖維呈藍(lán)綠色。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：照射前、后血清TGF-1平均水平用±s表示，兩樣本均數(shù)用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較用F檢驗(yàn)和SNK方法,統(tǒng)計(jì)處理采用SAS軟件包。2結(jié)果2.1大體觀察(1)體重：照射前3個(gè)組平均體重3.0kg,照射后均有不同程度消瘦、體重下降,最少者減少0.4kg,最多者減少1.2kg,平均0.5kg。(2)放射損傷臨床表現(xiàn)：食管損傷癥狀主要表現(xiàn)為進(jìn)食減少、明顯消瘦;肺損傷癥狀主要表現(xiàn)為呼吸急促、活動(dòng)受限;脊髓損傷癥狀主要表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)、雙后肢肌力減退,出現(xiàn)時(shí)間從1周到6周不等。放射損傷的程度與照射劑量成

11、正比,即照射量大者癥狀出現(xiàn)早,損傷表現(xiàn)明顯。30Gy組照射1周后即進(jìn)食減少、消瘦,2周后陸續(xù)出現(xiàn)脊髓損傷表現(xiàn);10Gy組則在6周后才出現(xiàn)各種損傷癥狀。照射后4周胸部CT掃描20Gy組2個(gè)肺尖和左上肺呈炎癥改變,其它2個(gè)組未見明顯異常表現(xiàn),而12周時(shí)胸部CT各組均見不同程度炎癥表現(xiàn)。(3)開胸所見：照射后4周處死10Gy組肉眼觀察無明顯改變,8周處死20Gy組5只實(shí)驗(yàn)兔可見1.54.0mL淡黃色心包積液,3只可見12mL淡黃色清亮胸腔積液;30Gy組3只實(shí)驗(yàn)兔可見2.04.5mL淡黃色心包積液;部分實(shí)驗(yàn)兔特別是12周處死者可見有縱膈纖維結(jié)締組織粘連。2.2血清標(biāo)本測(cè)定結(jié)果(1)照射前、后及不同時(shí)

12、間的血清TGF-1水平比較：照射前血清TGF-1最高達(dá)9.88 g/L,最低達(dá)1.58 g/L,平均為3.12±2.35 g/L；照射后血清TGF-1最高達(dá)16.23 g/L,最低達(dá)1.30g/L,平均為4.79±3.10g/L，二者比較差異有極顯著意義(t=4.51,P<0.01)。照射后1，2，4周的血清TGF-1平均水平分別為5.47±2.01g/L，4.27±2.87g/L，5.66±3.73g/L,均高于照射前，照射前、后組間差異有顯著意義(F=3.33,P<0.05)。照射后第2周比第1周降低,第4周又升高,但照射3個(gè)組

13、之間比較差異無顯著意義(F=0.97, P>0.05)。(2)不同劑量組血清TGF-1水平比較：10Gy組血清TGF-1最高達(dá)10.33g/L,最低達(dá)1.34g/L,平均為5.13±2.62g/L; 20Gy組血清TGF-1最高達(dá)11.25g/L,最低達(dá)2.05g/L,平均為4.48±2.59 g/L;30Gy組血清TGF-1最高達(dá)16.23g/L,最低達(dá)1.30g/L,平均為5.65±3.84g/L。與照射前比較,3個(gè)組均明顯升高,差異有顯著意義(F=2.79,P<0.05);3個(gè)組之間比較,差異無顯著意義(F=0.90,P>0.05)。2.3

14、組織標(biāo)本結(jié)果(1)HE染色：各劑量組照射后4周均見照射區(qū)域充血水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的部位主要在肺周邊的肺泡腔內(nèi)和細(xì)支氣管、小血管周圍及終末支氣管、微血管腔內(nèi);細(xì)支氣管和終末支氣管內(nèi)粘膜壞死脫落,巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);小血管內(nèi)瘀血,小動(dòng)脈平滑肌變性、空泡樣改變。炎癥改變以8周后明顯,特別是20Gy組,肺組織內(nèi)觀察到大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞(1)。各劑量組照射后12周均有部分肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡腔變小,纖維化改變。120Gy組8周，肺組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（HE染色×66）(2)免疫組化染色：空白對(duì)照組肺組織未見TGF-1陽性染色,各照射組照

15、射后4周即觀察到TGF-1陽性染色,12周后染色加深,20Gy組和30Gy組更加明顯,18周時(shí)仍可觀察到較明顯的TGF-1陽性染色顆粒。染色顆粒主要出現(xiàn)在：肺泡間隔中和肺泡壁上；小血管、細(xì)支氣管、終末支氣管周圍和內(nèi)膜上；巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞內(nèi)，與HE染色炎性細(xì)胞出現(xiàn)的部位相同(2)。230Gy組8周，TGF-1陽性染色（免疫組化×132）(3)VB染色：與對(duì)照組相比,各照射組均觀察到照射區(qū)域內(nèi)膠原纖維明顯增加,染色異常。染色異常的部位與HE染色、免疫組化觀察相符,主要在肺泡間隔中和肺泡壁上及小血管、細(xì)支氣管、終末支氣管周圍,并向鄰近肺泡內(nèi)長(zhǎng)入。膠原纖維增加的程度與劑量相關(guān),高劑量組比低

16、劑量組明顯。同時(shí),照射后8周在20Gy組還觀察到小動(dòng)脈周圍彈力纖維染色異常(3，4)。33320Gy組8周，小動(dòng)脈周圍膠原纖維異常染色（VB染色×33）4Gy組8周，細(xì)支氣管周圍膠原纖維異常染色（VB染色×33）3討論肺組織放射性損傷是腫瘤放射治療中的嚴(yán)重并發(fā)癥，由放射性肺炎和放射性纖維化兩部分組成。肺纖維化可以伴隨放射性肺炎發(fā)生，也可能單獨(dú)發(fā)生，特別是放射治療合并化療時(shí)其發(fā)生的可能性更大。Emami等1認(rèn)為照射體積與劑量是產(chǎn)生放射性肺損傷的最主要因素，但未能解釋為什么有些人發(fā)生放射性肺炎或肺纖維化而有些人不發(fā)生，因此在很大程度上限制了許多腫瘤的放射治療。近年來，許多學(xué)者從

17、生物學(xué)角度研究了產(chǎn)生放射性肺損傷的機(jī)制。Adamson等2認(rèn)為肺內(nèi)存在著表皮成纖維細(xì)胞調(diào)控系統(tǒng),調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的代謝，使其參與組織修復(fù)而又不過度增長(zhǎng)導(dǎo)致肺的纖維化。放射治療時(shí)，放射損傷的靶細(xì)胞肺泡型細(xì)胞受到損傷，分泌功能喪失，使成纖維細(xì)胞異常增生，產(chǎn)生肺纖維化。Rubin等3提出肺組織對(duì)放射性損傷的反應(yīng)是一個(gè)多種細(xì)胞相互作用的復(fù)雜過程，有些細(xì)胞受到放射損傷后對(duì)成纖維細(xì)胞有直接刺激作用，也有巨噬細(xì)胞分泌TGF-1蛋白對(duì)成纖維細(xì)胞的間接作用，而后者在肺纖維化中起著非常重要的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明在正常組織放射損傷中，生物學(xué)因素TGF-1可能起了關(guān)鍵性的作用4-6。本研究采用檢測(cè)血清TGF-1

18、的變化與組織中TGF-1蛋白表達(dá)相比較,方法較文獻(xiàn)報(bào)道的更接近臨床應(yīng)用。照射后血清TGF-1表達(dá)均高于照射前,差異有顯著意義,提示肺組織放射損傷后分泌TGF-1進(jìn)入血液循環(huán)，血清中TGF-1升高可間接反映肺組織損傷的可能性。照射后2周血清TGF-1較第1周降低,4周后再度升高,可能與肺組織中放射敏感靶細(xì)胞如巨噬細(xì)胞受照射后損傷的修復(fù)過程有關(guān)。不同劑量組中血清TGF-1表達(dá)以30Gy組最高,與文獻(xiàn)報(bào)道相符7。各劑量組之間比較，差異無顯著意義，說明血清TGF-1的變化與照射劑量及個(gè)體差異之間的關(guān)系尚有待于進(jìn)一步研究。肺組織的急性放射損傷以20Gy組最為明顯。在各劑量組、各時(shí)間段均可觀察到膠原纖維在

19、肺組織的異常增生,高劑量組和觀察期長(zhǎng)者更加明顯，提示TGF-1的表達(dá)與正常肺組織的放射損傷，特別是晚期損傷肺纖維化密切相關(guān)。上述結(jié)果與本研究的早期結(jié)果(見文獻(xiàn)8)和國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致3，9，10。它進(jìn)一步說明肺的放射性損傷是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,不能僅僅用照射劑量和體積等因素來解釋,還需要從生物學(xué)角度來探討其內(nèi)在原因。本研究希望能通過在區(qū)別個(gè)體差異的基礎(chǔ)上為放射治療計(jì)劃個(gè)體化和并發(fā)癥預(yù)防提供新的思路。作者單位：200433 上海，中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院放射治療科參考文獻(xiàn)1Emami B,Lyman J,Brown A,et al.Tolerance of normal tissues

20、to therapeutic irradiation.Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1991，21(1):109-122.2Adamson YR,Hedgecock C,Bowden DH.Epithelial cell-fibroblast interactions in lung injury and repair. AM J Pathol,1990， 137(2):385-392.3Rubin P,Finkelstein J,Shapiro D.Molecular biology mechanisms in the radiation induction of pulmonary injury syndromes: interrelationship between the a