1、地塞米松對熱休克蛋白70誘導的THP-1細胞TLR-4mRNA表達變化影響的實驗研究浙江大學附屬第一醫院張德林 祝勝美 甄威趙赟 胡克儉 蔣豪目的：用THP-1細胞進一步探討地塞米松對天然免疫受體TLR2、4受體及其與內源性誘導因子熱休克蛋白70作用的影響。方法：以RPMI 1640培養THP-1細胞， 24孔板每孔加入無血清培養液1ml孵育5×106 THP-1細胞置于37度和5%CO2培養，以1、 5g/ml和10g/ml的HSP70或1、 10、100M的地塞米松；對照組不加任何藥物，孵育0、3、6、12、24小時后收集上清和細胞，以RPMI 1640培養THP-1細胞，24孔

2、板每孔以無血清培養液1ml加0、1、10、100M地塞米松孵育5×106 THP-1細胞置于24孔板在37度和5%CO2培養3小時后加入 g/ml的HSP70；對照組為不加任何藥物，孵育3小時后收集上清和細胞。以ELISA測上清液TNF-，IL-6，IL-10等細胞因子，細胞提取總RNA，逆轉錄并以熒光定量PCR檢測TLR2、TLR4表達。結果：不同濃度HSP70刺激THP-1細胞，TLR2mRNA于36小時表達最高， TLR4mRNA均于3小時表達最高值，上清液中TNF-含量在36小時達高峰，上清液IL-6含量在3小時達高峰值；相同時間點比較，TLR2mRNA、TLR4mRNA表達

3、呈HSP70濃度依賴增加，TLR2mRNA表達的倍數變化較TLR4mRNA表達變化明顯。相同時點上清液TNF-、IL-6含量呈HSP70濃度依賴性增加趨勢。不同濃度地塞米松刺激THP-1細胞， TLR2mRNA和TLR4mRNA表達變化與對照組相比，二者均明顯升高或P<0.01)，TLR2mRNA612小時表達最高，TLR4mRNA的表達均于6小時最高；相同時間點比較，TLR2mRNA、TLR4mRNA表達均呈DXM濃度依賴性降低。上清液TNF-、IL-6濃度表現為相似的變化規律，上清液IL-10濃度在612小時達高峰，隨著DXM濃度升高，上清液IL-10含量逐漸增加，即有濃度依賴性增加

4、趨勢。分別用不同濃度DXM（0，1、10 and 100M）孵育THP-1細胞3小時，再加入HSP70 g/ml刺激3小時。TLR2mRNA 和TLR4mRNA的表達呈現協同增強作用，其中TLR2mRNA增加的幅度更為明顯，但是，隨著DXM濃度增加TLR2mRNA、TLR4mRNA表達增加的幅度降低。上清液TNF-、IL-6、IL-10含量與對照組相比均有高度顯著性差別（P1）。DXM濃度增加，上清液TNF-和IL-6含量逐漸降低，而上清液IL-10濃度的含量的變化呈地塞米松濃度依賴性增高。結論：地塞米松通過誘導TLR2、4表達而促進炎性細胞因子產生；地塞米松濃度增加也通過增加IL-10的分泌

5、而抑制免疫細胞作用。DXM具有協同增強HSP70誘導的TLR2、TLR4表達而具有增強免疫的作用；DXM濃度的增加，這種協同作用減弱，部份機制可能與抗炎細胞因子如IL-10等的分泌增加有關。 熱體克蛋白(heart shock protein 70， HSP70 )家族含有從66kDa到78Da大小一系列同分異構體蛋白，廣泛存在于細胞真核細胞和原核細胞質和細胞核內，正常情況下表達較低，而各種廣泛的應激因素（包環境因素、生理因素或各種病理因素）能誘導細胞內HSP70合成明顯增加52，因此，也是一種應激蛋白，除了起分子伴侶作用53，如新合成蛋白的折疊、運輸、成熟和降解等外，在各種應激時也起細胞保護

6、作用。最近發現HSP70是TLR4的內源性配體，能通過CD14誘導促炎細胞因子TNF-、IL-1、IL-6等產生5457。地塞米松是強效的抗炎物質，作為主要的免疫調節劑一直應用至今，能影響炎性級聯的多重通路，能明顯改善了嚴重敗血癥、膿毒性休克、和ARDS中的應用能夠降低死亡率5860，體外循環前給予地塞米松能明顯減輕體外循環管道系統所致的內源性系統性炎性反應綜合征，降低炎性介質的釋放、改善術后臨床病程6162，但是，糖皮質激素也能惡化這些疾病的病程和激活不利的炎性級聯反應，而導致死亡。那么，它是如何對天然免疫系統的模式識別受體TLR-4作用？及對TLR-4內源性配體HSP70與其受體作用有何影

7、響？為了了解糖皮質激素的免疫調節機制，本章節用THP-1細胞進一步探討地塞米松對天然免疫受體TLR4mRNA及其與內源性因素激動因子熱休克蛋白70作用的影響。材 料 和 方 法1 主要試劑與儀器 地塞米松（批號:030105，上海信誼金朱藥業有限公司）Trizol（GibcoBRL公司，美國）；SuperscriptTM(Gibco BRL公司，美國)；Taq 酶及逆轉錄酶 (Promega公司，美國)；PCR 引物（上海申友公司）；PCR Marker 及dNTP（北京鼎國生物技術有限責任公司）；SYBR Green I（上海開放科技發展有限公司）；MDA及NO試劑盒(南京建成生物工程研究所

8、)；人單核細胞株THP-1（中國科學院上海細胞所）；HSP70（MBL， 日本）；IL-6 、TNF-ELISA試劑盒（ebioscience，USA）；小牛血清（HYCLONE， USA）；無血清培養液（SIGMA ，USA）。其他試劑均為國產分析純。熒光PTC-225光定量實時PCR儀（MJ Research公司，美國）；電熱恒溫水浴箱（上海醫療器械線七廠）； DY-A電泳儀（上海康達電子儀器廠）； 2 細胞培養：THP-1細胞培養于RPMI 1640培養液，37，5% CO2下生長，THP-1為懸浮生長型細胞，23天更換培養液，細胞生長至46×106/ml時及時傳代。3 熱休克

9、蛋白70（HSP70）和地塞米松（DXM）刺激培養THP-1細胞：（1）以無血清培養液1ml孵育5×106 THP-1細胞置于24孔板 在37度和5%CO2培養，加入 1、 5g/ml和10g/ml的HSP70；對照組為不加任何藥物，僅以無血清培養液1ml孵育至不同時間。在0、3、6、12、24、48小時后收集上清貯于-70冰箱，細胞加Trizol1ml貯于-20冰箱備用。（2）. 以1640無血清培養液1ml孵育5×106 THP-1細胞置于24孔板 在37度和5%CO2培養，加入1、 10、100M的地塞米松；對照組為不加任何藥物，僅以無血清培養液1ml孵育至不同時間在

10、0、3、6、12、24、48小時后收集上清貯于-70冰箱，細胞加Trizol1ml貯于-20冰箱備用。4 地塞米松預處理后熱休克蛋白70刺激THP-1細胞：以1640無血清培養液1ml加0、1、10、100M地塞米松孵育5×106 THP-1細胞置于24孔板在37度和5%CO2培養3小時后加入g/ml的HSP70；對照組為不加任何藥物，僅以無血清培養液1ml孵育至不同時間。3小時后收集上清貯于-70冰箱，細胞加Trizol1ml貯于-20冰箱備用。5 熒光定量實時RT-PCR法：室溫解凍-70Trizol保存的THP-1細胞，加入氯仿200l, 用力振蕩，室溫靜置5min，412 0

11、00g離心15min，吸上清，加入異丙醇500l，混勻，室溫靜置10min，4 12 000g離心10min，棄上清，將沉淀用75%乙醇1ml洗滌，棄上清，室溫下自然干燥1020min，加DEPC處理水20l溶解RNA，作為逆轉錄模板。逆轉錄體積20l （引物0133mol/L ,1 ×RT 緩沖液,DDT 10 mmol/L ,100 U SuperscriptTM,16 U Rnasin ,42 逆轉錄50 min）。TLR4、HSP70 、TNF2和GAPDH 的引物序列以及產物長度見表1。 取逆轉錄產物2l與反應液48l混合 上下游引物各1 l , 4l dNTP,10

12、15;PCR 緩沖液5l, 3l SYBR Green I, 2l Taq 酶, 雙蒸水32l。熒光定量實時 PCR儀擴增，反應條件TNF-和HSP70為94變性 3min， 9430s, 5530s, 7030s, 共30個循環； TLR4、GAPDH 94變性3min， 9430s， 5830s ，70，共30個循環。求得各基因的CT值。采用2-Ct方法2，即以管家基因GAPDH的Ct值標準化目的基因Ct值，得到各時點目的基因初始模板相對量 ，再計算各時點目的基因初始模板相對量與CPB前目的基因初始模板相對量的比值， 分析各時點目的基因TLR-4、HSP70、TNF-mRNA表達相對量的變

13、化。6 ELISA測上清液TNF-、IL-6血漿保存于-70冰箱，標本收集齊后用ebioscience公司ELISA試劑盒檢測，（3）血漿NO濃度測定用硝酸還原法，血漿丙二醛(MDA)濃度測定用硫代巴比妥酸法（Thibabituric Acid, TBA）法，試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。7 統計學處理 , 資料以均數±標準差()表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用配對t檢驗，。 結 果 1不同濃度HSP70和DXM刺激THP-1細胞TLR4mRNA表達的變化表1及圖34， 分別以1g/ml、5g/ml及10g/ml不同濃度HSP70刺激THP-1細胞324小時，經

14、熒光定量PCR檢測TLR4mRNA表達變化，與對照組相比，二者均明顯升高，TLR2mRNA于36小時表達最高， TLR4mRNA均于3小時表達最高值；相同時間點比較，TLR4mRNA表達呈HSP70濃度依賴增加。見表2及圖5、6，分別用1M、10M、 100M的濃度DXM刺激THP-1細胞324小時，經熒光定量PCR檢測TLR4mRNA表達變化，與對照組相比，明顯升高， TLR4mRNA的表達均于6小時最高；相同時間點比較，TLR4mRNA表達均呈DXM濃度依賴性降低。表2不同濃度的DXM（M）刺激培養THP-1細胞TLR2、4mRNA表達倍數的變化（Mean±SD）HSP70（g/

15、ml）DXM（M）1510110100CON1111113h2.76±0.11*3.63±0.22*4.29±0.14*+1.87±0.12*±6h2.40±0.17*3.11±0.19*4.08±0.28*+±0.22*±0.20*±0.12*+#12h2.03±0.14*2.60±0.18*3.44±0.24*+2.40±0.12*2.34±0.11*±0.10*+#24h1.67±0.10*2.38±

16、0.30*2.97±0.10*+#±0.14*±0.12*±0.16*+#注：與同一時間CON組相比：；與同一時間點1g/ml組相比：5；與同一時間點5g/ml組相比#表2不同濃度的DXM（M）刺激培養THP-1細胞TLR2、4mRNA表達倍數的變化（Mean±SD）110100TLR2mRNATLR4mRNATLR2mRNATLR4mRNATLR2mRNATLR4mRNACON1111113h±0.17*1.87±0.12*2.08±0.14*±0.12*±6h±0.27*±

17、;0.22*±0.10*±0.20*2.36±6*+#±0.12*+#12h±0.21*2.40±0.12*2.73±0.19*2.34±0.11*2.55±0.26*+#±0.10*+#24h±0.14*±0.14*±0.13*±0.12*±0.12*+#±0.16*+#注：與同一時間CON組相比：；與同一時間點1M組相比：；與同一時間點1M組相比：#不同濃度地塞米松預處理對HSP70刺激THP-1細胞引起TLR2、4mRNA表達的變

18、化見圖7、8，分別用1M、10M、 100MDXM孵育THP-1細胞3小時，再加入HSP70 g/ml刺激3小時， TLR2mRNA 和TLR4mRNA的表達呈現協同增強作用，其中TLR2mRNA增加的幅度更為明顯，但是，隨著DXM濃度增加TLR2mRNA、TLR4mRNA表達增加的幅度降低。不同濃度的HSP70刺激培養THP-1細胞上清液TNF-、IL-6表達的變化 見表3和圖910，用不同濃度的HSP70刺激培養THP-1細胞，上清液TNF-含量與對照組相比，各值差別均有統計學意義（P）；不同濃度的HSP70刺激, 相同時點上清液TNF-含量呈濃度依賴性增加趨勢； 1g/ml和5g/ml濃

19、度刺激時，上清液中TNF-含量在6小時達高峰，10g/ml濃度刺激時，在3小時達高峰。不同濃度的HSP70刺激培養THP-1細胞，上清液IL-6含量與對照組相比，各值差別均有高度統計學意義（P1）；不同濃度刺激相同時點上清液中IL-6含量呈濃度依賴性增加；而各種濃度HSP70刺激，均在3小時上清液IL-6含量達高峰值。表3不同濃度的HSP70刺激培養THP-1細胞上清液TNF-、IL-6濃度的變化(pg/ml,Mean±SD)CON 1g/ml 5g/ml 10g/mlTNF- IL-6 TNF- IL-6 TNF- IL-6 TNF- IL-6 3h 12±1 ±

20、; ±15.3* ±28.9* 6±*+ ±62.1* ±48.0*+# ±88.4*+#6h 1±17.1 ± ±44.* ±58.7* 719.3±65.2* ±58.0* ±44.8*+ ±93.8*+#± ± ±18.5* ±48.1* 4±41.7*+ ±25.5* 529.3±21.9*+ ±45.9*+#24h 124.7± ± ±1

21、6.7 ±21.2* 344.7±25.5* ±49.9*+ 434.7±27.6*+ ±44.5*+#注：與同一時間CON組相比：*P<0.05, *；與同一時間點1g/m組相比：；與同一時間點5g/m組相比#，#七 不同濃度的地塞米松刺激培養THP-1細胞上清液TNF-、IL-6表達的變化 見表4及圖1112，不同濃度的DXM刺激培養THP-1細胞后上清液TNF-濃度均在36小時達高峰；不同濃度對應時點相比，DXM濃度增高，相應時點TNF-濃度值逐漸降低，即呈DXM濃度依賴性下降；與對照組相比，1MDXM刺激后各時點差異均有顯著性（1

22、0.05）；10MDXM刺激后36小時有顯著性差異（P），而100MDXM刺激后3小時有顯著性差異（P）。不同濃度的DXM刺激培養THP-1細胞后上清液IL-6濃度均在36小時達高峰；不同濃度對應時點相比，DXM濃度增高，上清液IL-6濃度降低，呈DXM濃度依賴性降低；與對照組相比，100MDXM刺激后6和24小時沒有顯著性差異（P），而其他各值均有顯著性差別。1MDXM刺激和10MDXM刺激后36小時有顯著性差異（P），而100MDXM刺激后6小時有顯著性差異（P）表4不同濃度的DXM刺激培養THP-1細胞上清液TNF-、IL-6表達的變化(pg/ml,Mean±SD) CON 1

23、M 10M 100MTNF- IL-6 TNF- IL-6 TNF- IL-6 TNF- IL-6 3h 115.7±17.7 18±23.7 294.1±32.±32.1* 254.2±34.4* ±26.0* ±21.±20.7+6h 152.5±24.8 ±±±±±27.8* ±±13.6*+12h 127.6±19.5 19± 244.7±24.±±±28.4 177.

24、3±±24h 115.0±15.0 ±30.±±±±±22.4 ±注：與同一時間CON組相比：；與同一時間1M組相比：九 不同濃度的地塞米松預處理對熱休克蛋白70刺激引起培養THP-1細胞上清液TNF-、IL-6和IL-10濃度的影響見表6及圖14，分別以0、1、10、100M地塞米松孵育THP-1細胞3小時后， 加入 g/ml的HSP70刺激3小時, 測上清液TNF-、IL-6、IL-10含量與對照組相比無顯著差別均有高度顯著性差別（P1）。各種濃度對應時點相比，1M地塞米松預處理后上清液TN

25、F-和IL-6含量顯著高于0M地塞米松預處理后上清液TNF-和IL-6含量，隨后，DXM濃度增加，上清液TNF-和IL-6含量逐漸降低，100MDXM預處理組低于0MDXM預處理組。而上清液IL-10濃度的含量的變化呈地塞米松濃度依賴性增高。表6不同濃度的地塞米松預處理對HSP70刺激引起培養THP-1細胞上清液細胞因子表達的影響(pg/ml,Mean±SD) CON0M1M10M100MTNF-622.0±49.9*1593.1±94.1*+898.0±57.3*+$562.7±36.5*$#IL-6763.8±62.1*1299.

26、5±108.3*+832.6±63.0*$415.9±59.3*+$#IL-10626.5±36.3*+907.4±50.1*+$1117.8±127.5*+$注：與對照組比*P<0.01；與0M相比+ P<0.05，+ P<0.01；與1M相比$5；$ P<0.01；與10M相比# 注：與同一時間對照組比*P<0.01；與同一時間0M組相比+ P<0.05，+ P<0.01；與同一時間1M組相比$5；$ P<0.01；與同一時間10M組相比#討 論幾乎對穩態環境的任何威脅或應激都會引起

27、血漿糖皮質激素水平的升高，以提高機體抗應激能力，這是糖皮質激素用于臨床治療的依據。而對其如何實現這種作用的機制至今仍不是很清楚。通常認為糖皮質激素增強對穩態刺激（如出血、代謝紊亂、感染、焦慮等）的機體防御功能, 即具有抗炎和免疫抑制特性。HSP70能激活免疫系統，具有抗腫瘤、激活抗原呈遞細胞產生細胞和體液免疫63，各種應激因素均能產生HSP70。Fisher64等研究表明，糖皮質激素孵育CHO-細胞，然后進行熱休克，能增加CHO細胞的應激忍耐狀態，而先行進行熱休克后給與糖皮質激素治療，未能出現進一步熱忍耐。因此，推測熱休克蛋白70和糖皮質激素信號通路存在聯系。近來發現熱休克蛋白新的信號轉導途徑

28、，即與LPS類似的，通過TLR4進行信號轉導。和其他研究者5457報道一致，本實驗研究也表明，HSP70刺激THP-1細胞能明顯上調TLR2mRNA及TLR4mRNA表達以及上清液TNF-和IL-6含量，而且，這種作用具有HSP70的濃度依賴性，說明了免疫作用與TLR2、4進行信號轉導通路均有關，其中TLR2mRNA上調更加明顯。通過地塞米松孵育THP-1后，再觀察HSP70刺激對TLR2、4作用的影響。結果表明，低濃度的DXM孵育能協同增強HSP70刺激TLR2、4mRNA的表達，隨著DXM濃度增加，則這種協同作用逐漸減弱，但是，100MDXM孵育組仍明顯高于對照組；同時，各組上清液炎性介質

29、含量也表現為類似的變化規律，TNF-和IL-6也明顯高于對照組，但DXM濃度增加，各種炎性介質逐漸下降。這說明了DXM在低濃度時具有增強HSP70的免疫作用，隨著DXM濃度的增加，則出現抑制HSP70的免疫作用。Liao等65應用離體原位肝灌注系統觀察到相似的結果，他們發現在原位肝灌注系統給與基礎水平（35ng/ml）或應激水平(350ng/ml)的氫化可的松能誘導細胞因子IL-6和TNF-a釋放，而同時給予內毒素，則基礎劑量糖皮質激素增強細胞因子產生，應激劑量則抑制細胞因子的產生。近來也有其他一些作者研究報道了地塞米松對免疫具有抑制和增強雙向作用。Wilckens 79等報道以前認為糖皮質激

30、素對細胞因子抑制的作用，是在超生理范圍觀察到的結果。但在生理濃度內他們似乎有抑制和增強免疫作用80-81。這種自相矛盾的結果正是說明了糖皮質激素抗應激反應的復雜性，糖皮質水平的增加，不能抵抗應激本身，而只是提高細胞對應激的正常反應，防止過度的反應。DXM的對HSP70免疫增強作用可能是通過上調TLR2、4表達有關。DXM調節TLR2表達的機制還不清楚，糖皮質激素的受體位于細胞內，其炎性級聯廣泛，p38 MAPK、JNK和ERK1/2均是糖皮質激素的負性調節靶點6669。TLR2含有多種轉錄因子結合位點，包括：Sp1、 Ets和一些特征不明的結合位點，二者都被p38 信號轉導通路調節7073。I

31、masato等70報道糖皮質激素孵育HeLa細胞，上調MAPK磷酸酶-1而抑制p38 MAPK，協同增強非典型性Haemophilus influenzae 誘導的TLR2表達。而DXM上調TLR4的機制研究目前還未報道。熱休克蛋白的合成是由一個轉錄因子家族，即熱休克因子（heat-shock factors, HSF）所控制，已發現四種HSFs，但僅表明HSF-1調節對缺血、低氧、損傷等應激反應時的熱休克蛋白的表達。有報道74,75地塞米松能增加熱休克因子-1，而增加熱休克蛋白70合成, 也有報道地塞米松能抑制熱休克因子-176。地塞米松通過糖皮質激素受體與熱休克因子（HSF）串話(cross-talk)，增強或減弱HSF-1合成而調節熱休克蛋白70的合成，可能是其興奮或抑制TLR2、4表達的機制之一。IL-10是抗炎癥細胞因子，能有效抑制Th1細胞和B細胞合成細胞因子。它可通過改變細胞內信號傳導途徑而選擇性抑制有關細胞因子mRNA的合成，發揮抑制免疫應答的生物效應77，78。本實驗結果表明單用地塞米松刺激性THP-1細胞上清液IL-10含量呈地