1、低頻低強度超聲波誘導白血病細胞株K562凋亡的研究         08-12-20 13:50:00     編輯：studa20                       作者：馬燕 ，陳寶安，吳巍，姜藻，錢夢  摘要 目的：研究低頻低強度超聲

2、波誘導白血病細胞株K562凋亡的作用及其機制。方法：取對數生長期的K562細胞，分成實驗組和對照組，用MTT法計算細胞存活率，流式細胞儀判斷細胞凋亡，瑞氏染色和透射電鏡觀察細胞照射后有無出現凋亡，分光光度法檢測照射前后K562細胞Caspase3的活性改變。結果：超聲照射各組間細胞存活率與對照組相比有統計學差異，但組間無差異；瑞氏染色光鏡下可見0.03W組和0.10W組細胞出現細胞核固縮等早期凋亡的改變，0.25W組出現凋亡小體等典型凋亡改變；流式細胞儀檢測0.25W組凋亡率為38.87%；照射前后K562細胞Caspase3的活性無差異。結論：低頻低強度超聲波對白血病細胞株K562有誘導凋亡

3、作用，與照射強度和時間無明顯相關。低頻低強度超聲波誘導K562的凋亡可能不通過Caspase3的途徑。關鍵詞 超聲；白血病細胞株K562；凋亡cm-2 respectively.The exposure time were 30 and 60s respectively. K562 cells were incubated in 24well culture plates for different time of periods (6,24,48h) after sonication and the number of vital cells was tested by MTT assay.

4、 The morphology of apoptosis was analyzed by Wrights stain and transmission electron microscopy. The percentage of apoptosis were studied by flow cytometry (FCM). The activation of Caspase3 was tested by Caspase3 kit with spectrophotometric method. Results  The absorbance value of MTT decreased

5、 significantly after exposure. The highest apoptosis was found in 0.25W group after 30s sonication and 6h incubation. Morphological alterations observed in cells after exposure to ultrasound included: cell shrinkage, membrane blebbing, chromatin condensation, nuclear fragmentation, and apoptotic bod

6、y formation. FCM revealed that the percentage of apoptosis of cells in control group, in 0.03 Wgroup, in 0.10W group and in 0.25W group was 7.60%,35.95%,11.57% and 38.87% respectively.There were no significant difference of activation of Caspase3 between control and experimental group(0.25W group af

7、ter 30s sonication and 6h incubation). Conclusion  Low frequenchy and low intensity ultrasound can induce apoptosis in K562 cell lines after the exposure.The effect is not relevant to the intensity and exposure time of ultrasound.Key words：ultrasound； malignant myeloid cell lines K562；apoptosis

8、    超聲是一種機械波，對正常組織損傷小，而其誘導腫瘤細胞凋亡已有許多報道13。大部分研究集中于高頻超聲的殺傷作用46，目前高聚焦超聲(HIFU)已用于臨床7。低頻超聲相對于高頻超聲對周圍組織損傷更小，能夠抑制細胞生長和克隆形成，方向性好，并能增強化療藥物的作用，已成為研究熱點810。本實驗用低頻超聲波對白血病細胞株K562進行照射，研究不同劑量低頻超聲波對白血病細胞株K562的作用，為低頻超聲治療的臨床應用提供實驗數據。1  材料和方法11  材料111  細胞  K562白血病細胞株,由上海血液研究所提供,第一作者所在

9、實驗室常年培養。112   實驗儀器  東南大學江蘇鐵醫美達康醫療器械廠生產的NTY300A型低功率超聲腫瘤治療儀(簡稱治療儀)，輸出功率0.15.0，可調。113  主要試劑  MTT購于Sigma公司，annexin 購于BD公司，Caspase3試劑盒購于南京凱基生物公司（進口分裝），Bcl2/Bax試劑盒購于上海生工生物工程有限公司。12  方法121  細胞培養  K562細胞接種于含10%小牛血清的1640培養液中，置于37 、5%的CO2培養箱中，每23d傳代1次，試驗時取對數生長期細胞。122

10、60; 超聲照射  將處于對數生長期的K562細胞取出，離心后置24孔培養板中，RPMI 1640培養液重懸，調細胞濃度為5×105ml-1。分成對照組與實驗組，實驗組選取不同聲強（0.03、0.10、0.25Wcm-2）、不同時間(30、60、120s)的超聲輻射進行干預。 123  MTT法計算細胞存活率  將不同照射組以及對照組的細胞取出，分別計數，培養液稀釋至2×105ml-1 ，置于96孔板中，每孔100l；每組設3個復孔，向每孔加入MTT液10l（濃度為5gml-1），于37 、5%的CO2培養箱中孵育4h，1500rmi

11、n-1平板離心10min；棄上清后加入二亞甲砜（DMSO）100l孔-1，振蕩10min，待沉淀完全溶解后于550nm處在酶標儀上測吸光度（A）。按下式計算細胞存活率：細胞存活率（%）= A實驗孔/A對照孔×100%。124  流式細胞儀檢測  收集不同照射組和對照組K562細胞1×106個，冷PBS洗滌2遍后，用501×annexin結合緩沖液懸浮細胞，加annexin FITC5，室溫避光放置10min,再加PI10,混勻后室溫避光放置5min，冷PBS洗滌1遍，加3001×annexin結合緩沖液重懸細胞后，立即在流式細胞儀(BectonDickinson)上檢測，以annexin+/PI-判斷為早期凋亡, annexin+PI+判斷為晚期凋亡。125   Caspase3的檢測  收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，2000rmin-1離心5min，收集細胞（35）×106ml-1，用50冰冷的Lysis Buffer懸浮細胞，置冰上20min；410000rmin-1離心3min，把離心上清轉移到新的離心管中，并放置冰上；標準曲線法測定蛋白濃度，吸取50含50200g蛋白的細胞裂解上清；再加50的2×反應液，再加5Caspase3 底物