1、專題整合提升知識系統構建基礎知識j培養基1.無菌技術微生物的實驗室培養,培養基的制備實臉操作純化大腸桿菌平板劃線法稀釋涂布平板法、結果分析與評價,篩選菌株研究思路I統計整數口I設置對照微生物的培養與應用C土壤中分解尿素的細菌的分離與計數47二”-,土壤取樣實驗設計,樣品的選豆、I微生物的培養與觀察基礎知識笠霽笨，選纖維素分解困的篩選分解纖維素的微生物的分離'土壤取樣選擇培養實驗設計涂布培養;剛果紅染色法純化培養【必背要語】1 .實驗室常用煮沸消毒法、巴氏消毒法和使用紫外線或化學藥劑進行消毒，常用的滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌等。2 .微生物接種最常用的方法是平板劃線法和稀

2、釋涂布平板法。長期保存菌種可以采用甘油管藏法。3 .稀釋涂布平板法常用來統計活菌的數目，但統計結果往往比實際活菌數目低。4 .只有能合成月尿酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的選擇培養基分離該細菌。5 .鑒定分解尿素的細菌的方法是在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，據是否變紅進行判斷。,+Ci酶5/八一必比葡萄糖”山田6 .纖維素酶的作用是：纖維素一不西i鼠纖維一糖一f匍匐糖。7 .剛果紅與纖維素形成紅色復合物。當纖維素被分解后，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。規律方法整合整合一常見的消毒滅菌方法比較方法操作過程應用范圍煮沸消毒法100C煮沸56min日常生活中

3、廣泛使用巴氏消毒法在7075C煮30min或在80C煮15min牛奶、啤酒、果酒和醬油等不宜進行高溫消毒的液體化學藥劑消毒法用體積分數為70%75%的乙醇、碘酒涂抹，來蘇水噴灑等用于皮膚、傷口、動植物組織表面消毒，空氣、手術器械、塑料或玻璃器皿等紫外線消毒法30W紫外燈照射30min接種室空間消毒灼燒火菌法酒精燈火焰灼燒微生物接種工具如接種環、接種針或其他金屬用具等，接種過程中試管卬或錐形瓶口等干熱火菌法干熱滅菌箱160170C加熱12h玻璃器皿（如吸管、培養皿等卜金屬用具等凡不適宜用其他方法滅菌而又能耐高溫的物品高壓蒸汽火菌法100kPa、121C維持1530min培養基及多種器材、物品【例

4、1】下列有關微生物培養與應用的說法，正確的是（）A.天然培養基是指直接取自自然界不需加工的培養基B.接種前需對培養基、培養皿、接種環、實驗操作者的雙手等進行嚴格的滅菌處理C.大腸桿菌的純化培養過程包括培養基的配制和純化大腸桿菌兩個階段D.分離分解尿素的細菌時，尿素是培養基中唯一的氮源和碳源答案C解析天然培養基是成分不明確的培養基，并不是不需加工配制的培養基；實驗操作者的雙手需進行消毒處理；分離分解尿素的細菌時，尿素是唯一氮源但不是唯一的碳源。【例2微生物培養過程中，要十分重視無菌操作，現代生物學實驗中的許多方面也要進行無菌操作，以防止雜菌污染，請分析下列操作，錯誤的是（）煮沸消毒可以殺死微生物

5、的營養細胞和部分芽抱接種操作要在酒精燈火焰附近進行家庭制作葡萄酒時要將容器和葡萄進行滅菌培養基要進行高壓蒸汽滅菌加入培養基中的指示劑和染料不需要滅菌A.B.C.D.答案D解析無菌操作包括消毒和滅菌。需進行消毒處理的有操作人員的雙手等，需進行滅菌的有器皿、培養基、添加劑（指示劑或染色劑）等。煮沸可以殺死微生物的營養細胞和一部分芽抱，屬于消毒；為防止空氣中的雜菌污染，接種時要在酒精燈火焰附近進行；家庭制作葡萄酒時所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能滅菌；培養基常進行高壓蒸汽滅菌。故操作錯誤。整合二微生物的純化培養技術1 .技術流程2 .流程解讀(1)無菌技術：主要指消毒和滅菌，實驗中對操作者和

6、操作空間進行消毒，對實驗用具和培養基進行滅菌。實驗過程中嚴格遵循無菌技術。(2)倒平板：待培養基冷卻到50c左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。(3)平板劃線法：通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面，培養后獲得由單個菌體繁殖形成的菌落，從而實現菌種的純化培養。(4)稀釋涂布平板法：先將菌液進行系列梯度稀釋后涂布平板，在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而在培養基表面形成單個菌落，實現菌種的純化培養。易錯易混(1戶然界中多種微生物混雜在一起，研究菌種時需要將它們分離開來，微生物的純化培養技術實現了菌種的分離。2產板劃線法操作簡單，常

7、用于微生物的分離；稀釋涂布平板法操作復雜，稀釋度足夠高時，培養基上生長的菌落大都是由單個細菌形成的，除用于微生物的分離外，還可進行細菌的計數。例31943年，曾獲諾貝爾生理學或醫學獎的美國科學家魯里亞和德爾布呂克設計實驗，研究大腸桿菌的抗噬菌體突變是發生在接觸噬菌體之前還是之后。請閱讀以下資料回答下列問題：再將人的分解M介一第二少：將大腕軒赭的 由海分成小、日兩籌府.I情臺 第一步：將大腸桿萌在 廣1裝有加mL培并液的錐/ 形瓶中培養Uih恒溫前里一培葬24h第四紫：腐麗ii不扁麗赫麗麗麗K霖麗褊疏麗還藐AiAqAfjs的落斂 2 （4(1710BI培養皿中培養基的基本配方:配方蛋白月東乳糖K

8、H2PO4水瓊脂20%伊紅水溶液0.325%美藍水溶液pH含量10g10g2g1000mL25g20mL20mL7.27.4在培養基中加噬菌體的作用是;加伊紅與美藍的目的是。（2）由于大腸桿菌的同化作用類型是,因此，在培養基中還加入了一些相應的物質，其中是大腸桿菌生長的主要碳源，是氮源。（3）從生態學的角度看，噬菌體與大腸桿菌這兩種生物之間的關系是。（4）該實驗有兩個假設：假設一：大腸桿菌的抗噬菌體突變發生在大腸桿菌與噬菌體接觸之前。假設二：大腸桿菌的抗噬菌體突變發生在大腸桿菌與噬菌體接觸之后。你認為圖中的實驗結果支持上述哪個假設：,如果另一個假設成立的話，實驗結果應該是：（5）在這個實驗設計

9、中，研究者根據培養皿中菌落數的差異推斷，從而證明假設的成立。請你分析出現A4和A5實驗結果的原因：答案（1）選擇具有抗噬菌體突變的大腸桿菌便于識別大腸桿菌菌落（2）異養型乳糖蛋白月東（3）寄生（4）假設一A、B兩組所有培養基中菌落數沒有顯著差異（5）抗噬菌體變異發生的時間A5比A4早，具有抗噬菌體突變的大腸桿菌數較多，培養皿中出現的菌落數就多解析噬菌體與大腸桿菌的關系為寄生，有些大腸桿菌對噬菌體具有抗性，利用加噬菌體的培養基將其篩選出來。伊紅美藍培養基用于特異性鑒別大腸桿菌，其在此培養基上的菌落呈深紫色。大腸桿菌的同化作用類型為異養型，所以培養基中加了乳糖等含碳有機物。由于生物的變異具有不定向

10、性，且通過圖示可以看出，將A試管中10mL菌液先均分到50支試管中再培養24h以后涂布到50個含噬菌體的平板上，菌落數有了明顯差異，說明抗性發生了差異；B試管中10mL菌液先一起培養24h后再均分為50份分別涂布，結果各培養基菌落數相當，則說明假設一成立。若假設二成立，則A、B兩組所有培養基中菌落數應無顯著差異。通過培養基上菌落差異，可以推斷出大腸桿菌抗噬菌體變異時間的早晚。A5菌落數為103,A4為7,說明A5變異時間早，經過大量的繁殖，具有抗性的個體遠遠多于A40整合三有關分解尿素的細菌和纖維素分解菌的比較1.對比分析尿素分解菌和纖維素分解菌的分離和鑒定尿素分解菌的分離纖維素分解菌的分離原

11、理提供有利于目的菌株生長的條件（如營養、溫度、pH等），同時抑制其他微生物的生長，常用選擇培養基篩選I打崎素帝國施3纖維米業解菌刖展”“I色復箱里絲紅闿帽纖睢常廠匕鱷皿出領明用過程土壤取樣一樣品稀釋一培養與觀察土壤取樣一選擇培養一梯度稀釋一將樣品涂布于含剛果紅（CR）鑒別纖維素分解菌的培養基上一挑選產生透明圈的菌落一進一步鑒定鑒定酚紅指示劑（變紅）剛果紅（產生透明圈）/口加小選擇培養基：固體培養基，尿素為唯一氮源選擇培養基：液體，富含纖維素鑒別培養基：固體，加入剛果紅2.分解尿素的細菌和纖維素分解菌的分離流程比較分離流程分解尿素的細菌纖維素分解菌土壤取樣選擇富含有機質的土壤選擇富含纖維素的環境

12、選擇培養不進行選擇培養液體選擇培養基，增加纖維素分解菌的濃度梯度稀釋梯度稀釋到104、105、106倍梯度稀釋101106倍涂布平板淙布到選拄拈加上涂布到鑒別培養基菌種鑒定培養基中加入酚紅指示劑培養基中加入剛果紅染色劑【例4】下列關于尿素分解菌和纖維素分解菌的分離的敘述中，錯誤的是（）A.前者需要以尿素為唯一的氮源，后者需要以纖維素為唯一的碳源B.尿素分解菌能產生月尿酶，纖維素分解菌能產生纖維素酶C.兩個過程中都需要梯度稀釋D.剛果紅染色法也可以用于鑒定尿素分解菌答案D解析兩種細菌的分離都用到選擇培養基，分離尿素分解菌的培養基以尿素為唯一氮源，分離纖維素分解菌的培養基以纖維素為唯一碳源，A正確

13、；兩種細菌分別產生月尿酶和纖維素酶，B正確；由于在樣品中細菌的濃度較大，所以都要進行梯度稀釋，C正確；剛果紅染色法僅能用于纖維素分解菌的鑒定，D錯誤。熱點考題集訓1.在培養基中加入青霉素可以抑制細菌和放線菌；在缺乏氮源的培養基上大部分微生物無法生長；在培養基中加入10%NaCl溶液。利用上述選擇培養基依次能從混雜的微生物群體中分離出（）A.金黃色葡萄球菌、硝化細菌、放線菌B.固氮細菌、大腸桿菌、放線菌C.霉菌、固氮細菌、金黃色葡萄球菌D.固氮細菌、金黃色葡萄球菌、放線菌答案C解析青霉素可以抑制細菌和放線菌，在添加青霉素的選擇培養基上可以篩選分離真菌；在缺乏氮源的培養基上可以篩選分離固氮微生物；

14、加入10%NaCl溶液的培養基可以篩選分離金黃色葡萄球菌，C項正確。2.3個培養皿中分別加入10mL不同成分的培養基，然后接種相同的大腸桿菌樣液。培養36小時后，計數菌落數，結果如下表。下列選項不正確的是（）屆皿培養基成分菌落數I瓊脂、葡萄糖35n瓊脂、葡萄糖、生長因子250m瓊脂、生長因子0A.該實驗采用的是固體平板培養基B.該實驗采用稀釋涂布平板法接種C.I和H對照，說明大腸桿菌的生長不需要生長因子d.n和川對照，說明大腸桿菌的生長需要糖類答案C解析培養基中添加了瓊脂且能觀察到菌落，因此本實驗采用的是固體平板培養基，A項正確。對大腸桿菌進行菌落計數用的是稀釋涂布平板法，B項正確。I和n對照

15、，I中菌落數比較少，說明生長因子能促進大腸桿菌的生長，C項不正確。n和出對照，缺少葡萄糖的培養基中大腸桿菌不能生長，說明大腸桿菌的生長需要糖類，D項正確。3 .平板劃線法和稀釋涂布平板法是純化微生物的兩種常用方法，下列描述正確的是（）A.都要將菌液進行一系列的梯度稀釋B.平板劃線法是將不同稀釋度的菌液通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作C.稀釋涂布平板法是將不同稀釋度的菌液倒入液體培養基進行培養D.都會在培養基表面形成單個菌落答案D解析平板劃線法不需要進行梯度稀釋，稀釋涂布平板法是將不同稀釋度的菌液涂布到固體培養基的表面。平板劃線法和稀釋涂布平板法都能在培養基表面形成單個菌落。4 .下列能

16、選擇出分解尿素的細菌的培養基是（）A.KH2P。4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂、蒸儲水B.KH2P。4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、瓊脂、蒸儲水C.KH2P。4、Na2HPO4、MgSO47H2O、尿素、瓊脂、蒸儲水D.KH2P。4、Na2HPO4、MgSO47H2O、牛肉膏、蛋白月東、瓊脂、蒸儲水答案A解析要想分離尿素分解菌，應把尿素作為培養基中的唯一氮源。而B項中無氮源，C項中無碳源，D項中牛肉膏、蛋白陳都可以作為氮源。5 .淀粉酶可通過微生物發酵生產獲得，生產菌株在含有淀粉的固體培養基上可釋放淀粉酶分解淀粉，在菌落周圍形成透明圈。為了提高酶的產

17、量，研究人員欲利用誘變育種的方法獲得能產生較多淀粉酶的菌株。下列實驗步驟中不正確的是（）A.將生產菌株分為兩組，實驗組用一定劑量的誘變劑處理，對照組不處理B.制備含水、淀粉、氮源和無機鹽等成分的固體培養基，并進行滅菌處理C.把實驗組的菌株接種于多個配制好的培養基上，同時接種對照組，相同條件下培養D.觀察兩組菌株的菌落周圍是否出現透明圈，選出有透明圈的菌株即為所需菌株答案D解析利用誘變育種的方法獲得能產生較多淀粉酶的菌株，需要設置對照實驗，實驗組用誘變劑處理，對照組不處理，從而選出淀粉酶產量高的菌株，A項正確；篩選菌株需要將菌種接種到固體培養基上，培養基需在接種前進行滅菌處理，B項正確；為保證實

18、驗結果可靠、可信,要進行重復實驗，即將菌種接種在多個培養基上，C項正確；產淀粉酶的菌株在菌落周圍都形成透明圈，而產量高的菌株形成的透明圈大，因此應選擇透明圈大的菌株進行培養。6 .現有兩種固體培養基，已知其配制時所加的成分和含量如下表，用這兩種培養基分別去分離土壤中的兩種微生物，你認為它們適于分離（）成分KH2P04MgSO4-7H2ONaClCaSO42H2OCaCO3葡萄糖純淀粉甲培養基0.02%0.02%0.02%0.01%0.5%0.5%2%乙/口加小0.02%0.02%0.02%0.01%0.5%一一A.甲培養基適于分離自養型自生固氮菌；乙培養基適于分離異養型自生固氮菌B.甲培養基適

19、于分離異養型自生固氮菌；乙培養基適于分離自養型自生固氮菌C.甲培養基適于分離酵母菌；乙培養基適于分離真菌D.甲培養基適于分離自養型共生固氮菌；乙培養基適于分離異養型共生固氮菌答案B解析固氮菌中能獨立生存的是自生固氮菌。甲培養基中含有有機碳源（葡萄糖和淀粉），無氮源，由此推出該培養基適于分離異養型的自生固氮菌；乙培養基中不含碳源，也不含氮源，所以可用來分離自養型的自生固氮菌。7 .下圖表示從土壤中分離能降解酚類化合物對羥基苯甲酸的微生物的實驗過程。下列與該實驗將土雕樣而接種 到含有對羥星菸 甲酸的埼養孽中涂布到含對羥 基茶甲醛的培養 基平板&面匿落在平 板上生長相關的敘述中不正確的是（）

20、A.實驗中所用的培養基均屬于選擇培養基8 .圖中I、n過程實現了對目標微生物的稀釋C.統計處培養基中的菌落數并不一定代表接種到上的活菌數D.在處培養基上形成菌落的微生物同化作用類型為異養型答案B解析該實驗的目的是從土壤中分離能分解對羥基苯甲酸的微生物，所以使用的培養基為選擇培養基，A項正確。圖中I、n過程為選擇培養，目的是增大所分離的微生物的濃度，B項錯誤。處的菌落數往往比活菌的實際數目低，原因是一個或多個活菌繁殖后形成一個菌落，C項正確。所分離的微生物利用現成的有機物生長繁殖，所以該微生物的同化作用類型為異養型，D項正確。8.焦化廠活性污泥中富含難降解的有機物苯甲酰腫，是當前焦化行業環保治理

21、的難題。某同學通過查閱資料發現可通過細菌生物降解方法處理焦化廠污染物。下列有關分析錯誤的是（）A.配制以苯甲酰腫作為唯一碳源的選擇培養基進行篩選B.利用平板劃線法可以對初步篩選出的目的菌進行純化C.逐步提高培養基中苯甲酰腫的濃度可以得到高效降解污染物的優質菌株D.應該從農田土壤中篩選目的菌答案D9.有機農藥苯磺隆是一種除草劑，長期使用會污染環境。研究發現，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分離降解苯磺隆的菌株和探索其降解機制的實驗過程如圖甲、乙所示。僦,上壤樣品接種則純純化的種選擇培養圖甲但門酬溶液圖乙測定御黃 隆降解率(1)微生物生長繁殖所需的主要營養物質有碳源、水、 選擇培養基只能以苯磺隆作

22、為唯一碳源，其目的是四類，該實驗所用的(2)純化菌株時，通常使用的劃線工具是O劃線的某個平板培養后，第一劃線區域的劃線上都不間斷地長滿了菌，第二劃線區域所劃的第一條線上無菌落，其他劃線上有菌落。造成劃線無菌落可能的操作失誤有為探究苯磺隆的降解機制，將該菌種的培養液過濾離心，取上清液做圖乙所示實驗。該實驗的假設是，該實驗設計是否合理？為什么?答案(1)氮源和無機鹽使能利用苯磺隆的微生物能正常生長繁殖(2)接種環接種環灼燒后未冷卻；劃線未從第一區域末端開始目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白質不合理，缺少空白對照解析(1)微生物生長繁殖需要的主要營養物質包括碳源、氮源、水和無機鹽四類。根據題意可知，土壤中某些微生物有降解苯磺隆的能力，該實驗的目的是探索其降解機制，因此，需要從土壤中分離出有降解苯磺隆能力的微生物，故選擇培養時為了排除其他碳源的干擾，培中唯一碳源只能是苯磺隆。(2)純化菌株時，通常使用的劃線工具是無菌接種環。劃線的平板培養后，發現第一劃線區域的劃線上不間斷地長滿了菌落，第二劃線區域所劃的第一條線上無菌落，而其他劃線上有