1、弱陽離子交換毛細(xì)管整體柱的制備與蛋白質(zhì)分離摘要：以甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）為單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，正丙醇、1,4丁二醇和水為致孔劑，偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，在彈性石英毛細(xì)管內(nèi)原位制備了聚合物整體固定相基質(zhì)。優(yōu)化得到的最佳反應(yīng)物組成為GMA：EDMA：正丙醇：1,4-丁二醇：水=0.32：0.08：0.35：0.2：0.05，在60反應(yīng)24h,得到了孔徑分布在 100 300nm的大孔型整體固定相。用亞胺基乙二酸對整體柱進(jìn)行表面改性，制備了弱酸型陽離子交換整體固定相。優(yōu)化得到的最佳改性條件是：反應(yīng)時間24h、溫度 75 °C和pH12.0。本研

2、究制備的一根僅 5cm長的弱陽離子交換毛細(xì)管整體柱可以在 13min內(nèi)分離3種模型蛋白質(zhì)（粗卵蛋白、胰蛋白酶和溶菌酶）。 關(guān)鍵詞：毛細(xì)管整體柱，甲基丙烯酸酯，離子交換色譜，蛋白質(zhì) 1 前言 毛細(xì)管整體柱具有制備簡單、滲透性好、傳質(zhì)速度快、不用燒塞子和易于改性等優(yōu)點，近年發(fā)展迅速，已在毛細(xì)管電色譜和微液相色譜領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用1, 2。大量研究證明多孔聚合物基質(zhì)毛細(xì)管整體柱比多孔硅膠基質(zhì)毛細(xì)管整體柱更適合生物大分子的分離37。離子交換色譜是蛋白質(zhì)等離子性生物大分子分離的首選色譜分離模式，但離子交換毛細(xì)管整體柱的制備及其用于蛋白質(zhì)分離的研究還很少。相比于強陽離子交換固定相，弱陽離子交換固定相與生物

3、分子之間的相互作用比較溫和，因而不易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。Li等 8制備了丙烯酰胺基質(zhì)弱陽離子交換毛細(xì)管整體柱，Legido-Quigley等 9開發(fā)了聚苯乙烯基質(zhì)弱陽離子交換毛細(xì)管整體柱，均可用于蛋白質(zhì)的分離。但是，目前報道的弱陽離子交換整體柱通常采用兩步法改性，即先用乙二胺處理，再用氯乙酸反應(yīng)。本研究利用亞胺乙二酸進(jìn)行一步改性，簡化了合成步驟，獲得了具有羧酸基團的弱陽離子交換毛細(xì)管整體柱，并考察了其對蛋白的分離能力。 2 實驗部分 2.1 儀器與試劑 1100 HPLC QuatPump（Agilent，美國）；CL2001毛細(xì)管電泳 紫外檢測器（北京彩陸科學(xué)儀器有限公司）；N2000色譜數(shù)據(jù)處

4、理用軟件（浙江智達(dá)信息工程公司）；KYKY 2800掃描電鏡（中國科學(xué)院北京科學(xué)儀器研制中心）；AutoPoreIV9510汞滲透測孔儀（Micromeritics Inc.，美國）。 甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）和 -甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（-MAPS）（東京化成工業(yè)株式會社，日本）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，Acros Organics, 美國)；正丙醇和 1,4-丁二醇（北京市化學(xué)試劑三廠）；偶氮二異丁腈（AIBN，天津福辰化學(xué)試劑廠，使用前重結(jié)晶除雜質(zhì)）；亞胺乙二酸(IDA，分析純)、粗卵蛋白和溶菌酶（北京世紀(jì)華林生物科技有限公司）；胰蛋白酶（北京拜爾迪生物公司）。 2.

5、2 毛細(xì)管預(yù)處理 利用水泵的負(fù)壓使 0.1mol/L氫氧化鈉、水和丙酮依次通過毛細(xì)管，對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行活化與清洗，然后通入氮氣吹干。將 30% -MAPS的丙酮溶液充滿毛細(xì)管，密封，在 60水浴內(nèi)放置24h。然后用丙酮清洗毛細(xì)管，氮氣吹干，備用。 2.3整體聚合物基質(zhì)的原位合成將單體混合物（0.96mLGMA0.24mL EDMA)與三元致孔劑混合物（1.05mL正丙醇0.60mL 1,4-丁二醇0.15mL水）混合后，加入 12mg AIBN引發(fā)劑，超聲震蕩 5min使其充分溶解，然后通氮氣除氧3min。立即將此混合溶液注入處理過的毛細(xì)管中，并用硅橡膠將兩端密封，放入 60oC恒溫水浴中連續(xù)

6、加熱24h，通過熱引發(fā)在柱管中原位聚合制得聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱（基質(zhì)）。反應(yīng)完成后，將整體柱連接在液相色譜高壓泵上，用乙醇和水沖洗毛細(xì)管除去致孔劑、未反應(yīng)單體及其他可溶性物質(zhì)。 2.4 整體柱的陽離子交換修飾利用亞氨基乙二酸對聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體基質(zhì)進(jìn)行離子交換改性，在固定相上鍵合羧酸基，從而獲得弱陽離子交換整體固定相。將 5g亞氨基乙二酸和 2g NaCl加入 50mL 2mol/L碳酸鈉溶液中，用 NaOH調(diào)節(jié)pH至 12.0，用泵將該溶液以 10 L/min流速循環(huán)流過 1.3節(jié)制備好的整體柱基質(zhì)，75反應(yīng)24h。反應(yīng)完成后，用 10倍體積水沖洗，再用 0.1mol/L N

7、aOH溶液以 0.05ml/min流速沖洗整體柱。3 結(jié)果與討論 3.1 溫度對聚合物孔結(jié)構(gòu)的影響將相同配比的反應(yīng)混合物分別在50 、60 和 70 條件下反應(yīng) 24h，然后用壓汞法測定所得聚合物的孔徑分布和比表面積，圖 1是不同溫度下合成的整體材料的孔徑分布圖。實驗結(jié)果顯示：隨著聚合溫度的升高，整體材料的孔徑變小。50oC時孔徑主要分布在8001200nm；60 時主要分布在 100 300nm；70 孔徑小于 50nm。 根據(jù)原位聚合反應(yīng)機理，溫度主要影響聚合反應(yīng)過程中引發(fā)劑的分解速度。反應(yīng)溫度越高，單位時間內(nèi)引發(fā)劑形成的自由基數(shù)目越多，形成核的數(shù)目也越多。核數(shù)目的增加使得每個核的尺寸減小

8、，從而形成小的顆粒。而大孔材料是由相互交聯(lián)的顆粒組成的，所以小顆粒之間的空隙也小。另外，高溫下形成的小孔聚合物質(zhì)地緊密，能夠承受較高的壓力。綜合考慮整體柱基質(zhì)的滲透性和機械強度，本實驗選擇聚合溫度為60。 圖1 在 70(1)、60(2)和50(3)下甲基丙烯酸縮水甘油酯整體材料的孔徑分布圖 3.2致孔劑組成對聚合物孔結(jié)構(gòu)的影響形成大孔結(jié)構(gòu)的必要條件是交聯(lián)的核與反應(yīng)溶液間發(fā)生相分離。影響聚合物在反應(yīng)溶液中溶解性質(zhì)的重要因素是致孔劑的種類、組成和總含量。正丙醇、1,4-丁二醇和水組成的三元致孔劑體系不需要使用其它輔助溶劑就可以得到均一的混合溶液，能夠在很寬的范圍內(nèi)控制整體柱孔徑分布。 整體材料的

9、孔隙率可以通過調(diào)節(jié)單體與致孔劑的比例來控制。表 1所列 4根整體柱是不同單體和致孔劑配比。柱A、B、C和 D均為 5cm長，流速為10L/min，甲醇作流動相。實驗結(jié)果是：流動相不能從柱 A流出，柱 B、C和D的柱壓分別為 49bar、144bar和27bar。即致孔劑比例高的 B和D柱的滲透性明顯好于致孔劑比例低的 A和 C柱。 多元致孔劑的組成比對整體柱滲透性也有明顯影響。固定 GMA與 EDMA的比例，同時也固定致孔劑中水含量。實驗發(fā)現(xiàn)致孔劑中正丙醇含量減小，整體柱孔徑明顯增大。 表1 反應(yīng)混合物的配比GMA：甲基丙烯酸縮水甘油酯；EDMA：乙二醇二甲基丙烯酸酯 3.3 交聯(lián)劑含量對聚合

10、物孔結(jié)構(gòu)的影響固定致孔劑組成不變,GMA和 EDMA的比例分別為3/1、4/1和7/1。實驗結(jié)果顯示，隨著交聯(lián)劑 EDMA含量的減少，整體固定相平均孔徑從 2451nm增加到 5189nm。綜合考慮整體柱的滲透性和機械強度，本實驗選擇GMA/EDMA=4/1。綜合以上考察，最終選擇制備聚甲基丙烯酸縮水甘油酯基質(zhì)的最佳試劑配比為：GMA：EDMA：正丙醇：1,4-丁二醇：水=0.32：0.08：0.35：0.2：0.05。 3.4 整體固定相表面改性條件優(yōu)化離子交換功能層的主要性能參數(shù)是交換容量。影響交換容量的主要因素包括改性時間、溫度和 pH值。本實驗對上述三個條件進(jìn)行了優(yōu)化。測定交換容量時的

11、柱尺寸均為 50 ×0.32mm ID，柱容積為 4 L，流速為 0.1mL/min，模型蛋白質(zhì)溶菌酶的濃度為1mg/mL。 當(dāng)固定改性劑 pH12.0和反應(yīng)時間24h，反應(yīng)溫度分別為 40、60和 7575。 當(dāng)固定改性劑 pH12.0和反應(yīng)溫度 75，改性時間分別為8h、16h、24h和32h時，隨著改性時間的增加，交換容量迅速增加，改性時間達(dá)到 24h后,交換容量不再增加。因此，本實驗選擇改性反應(yīng)時間為24h。 當(dāng)固定反應(yīng)溫度 75和反應(yīng)時間24h，改性劑 pH值分別為11.0、12.0和 13.0時，隨著 pH增加，交換容量明顯增加。但過高的 pH值會破壞整體固定相與毛細(xì)管內(nèi)

12、壁之間的結(jié)合。當(dāng) pH值達(dá)到 13.0時，固定相很容易被沖出。綜合考慮，本實驗選擇pH12.0。 3.5 弱陽離子交換整體柱分離蛋白質(zhì)圖 2是三種模型蛋白質(zhì)（粗卵蛋白、胰蛋白酶和溶菌酶）在本實驗所制備的一根 5cm長的弱陽離子交換毛細(xì)管整體柱上的色譜圖。流動相 A為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.0）, 流動相B為流動相A中含1.0mol/L醋酸鈉（pH6.0）。梯度洗脫程序為： 0-2min，0% B； 2-2.1min,0-5% B；2.1-3.1min，5% B；3.1-3.2min，5-20% B；3.2-4.2min，20% B。進(jìn)樣體積 1 L。紫外檢測波長280 nm。3

13、種蛋白質(zhì)在 13min內(nèi)完全分離，表明該柱可以用于蛋白質(zhì)的分離分析。 電壓,voltage（V）圖2 蛋白質(zhì)（依次為粗卵蛋白、胰蛋白酶和溶菌酶）在弱陽離子交換毛細(xì)管整體柱上的分離4 結(jié)論：本研究以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，原位聚合制備了大孔型甲基丙烯酸酯整體基質(zhì)，再利用亞胺乙二酸進(jìn)行一步改性，獲得了具有羧酸基團的弱陽離子交換毛細(xì)管整體柱，該柱可用于蛋白質(zhì)的分離分析。 參考文獻(xiàn)：1 鮑笑嶺，許旭. 分析化學(xué)，2005，33（11）：16531658 2 馬繼平，丁明玉. 分析化學(xué)， 2006，34（9）：S272S277 3 Svec F, Frechet J M J. Anal.Chem.，1992，64：820822 4 Palm A, Novotny M V. Anal.Chem., 1997，69：44994507 7 M