1、肽含量檢測方法一三氯乙酸沉淀法（TCA-NSI）（可溶解小分子含氮物質定量測定）檢測項目檢測方法一.儀器設備三1.實驗室用樣品粉碎機或研缽2.分析篩：孔徑 0.45mm （40 目）氯3.分析天平：感量 0.0001g4.消煮爐或電爐5.滴定管：酸式，10、25mL6.消煮管：250mL。乙7.凱氏燒瓶：250mL8.離心管酸9 .凱氏烝餾裝置：半微量凱氏疋氮裝置氮10. 錐形瓶：150、250mL11.容量瓶：100mL12.燒杯：250 mL溶13.臺式離心機：定時，調速，轉速可達4000 轉/分指14.普通磁力攪拌器15.移液管：25 mL16.稱樣皿：數17 電熱式恒溫烘箱：可控制溫度

2、為105 2C的二. 試劑測1.硫酸：化學純，含量為 98%，無氮；2 混合催化劑：0.4g 五水硫酸銅，6g 硫酸鉀，均為化學純，磨碎混勻；疋3 氫氧化鈉：化學純，40%水溶液（mN）;4 .硼酸（GB 628 ）:化學純，4 %水溶液（m/V）;5 .混合指示劑：甲基紅 0.1 %乙醇溶液，溴甲酚綠 0.5 %乙醇溶液，兩溶液等體積混合；6 鹽酸標準溶液：鄰苯二甲酸氫鉀法標定，按GB 601 制備；鹽酸標準溶液：C （HCI ） =0.02mol/L。1.67mL 鹽酸（GB622 ,分析純），注入 1000mL 蒸餾水中7 .硫酸銨：分析純，干燥；&三氯乙酸：分析純，10 %水溶

3、液（m/V ）。9.蔗糖（HG3-1001）:分析純三.操作方法1.取稱樣皿一只，250mL 燒杯一只，離心試管六只，洗凈后置于烘箱中備用。2. 粉碎研磨，全部過 40 目篩，取篩下物約 5 克置于稱樣皿中，在105C的溫度下烘干 3h,取出，蓋好稱樣皿蓋，在干燥器中冷卻 30min ,稱重。再同樣烘干 1h,冷 去卩，稱重，直至兩次重量之差小于0.002g 為恒重。3. 稱取恒重后的樣品 mi克（注：樣品約 2 至 3 克），置于燒杯中，加蒸餾水 75mL 室溫下電磁攪拌 45 分鐘。將燒杯中溶液及沉淀搖勻，折入離心試管中，離心后收集上清液（1 號上清液）。注：離心轉速 2500 轉/分鐘，

4、離心時間 10 分鐘。4.取 1 號上清夜 25mL 加入 25mL10%勺三氯乙酸溶液，混合后靜置 20 分鐘。將燒杯中溶液及沉淀搖勻，折入離心試管中，離心后收集上清液（2 號上清液）。注：離心轉速 4000 轉/分鐘，離心時間 20 分鐘。5. 取 2 號上清液 25mL 小心移入干燥的 500mL 凱氏燒瓶中，加入混合催化劑 6.4g, 再加入12mL 濃硫酸和數粒玻璃珠，搖勻，將凱氏燒瓶置于電爐上加熱，開始小火，待樣品焦化、泡沫消失后，再加強火力，直至呈透明的藍綠色，然后繼續加 熱，至少2h.。待試樣消煮液冷卻，加入 20mL 蒸餾水，轉人 100mL 容量瓶中， 冷卻后用水稀釋至刻度

5、，搖勻，做為試樣分解液。安裝好半微量蒸餾裝置后，向接收瓶內加入 20mL 硼酸吸收液及 2 滴混合指示劑，并使冷凝管下端插入吸收液 內，蒸汽發生器的水中應加入甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，在蒸餾過程中保持 此液為橙紅色，否則需補加硫酸。準確移取試樣分解液10mL 注人蒸餾裝置的反應室中，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL 氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應室，將玻璃塞塞好，且在入口處加入密封，防 止漏氣。蒸餾 5min 降下錐形瓶使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾 1min，用蒸 餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內，然后停止蒸餾。6.蒸餾后的吸收液立即用0.02mol

6、/L 鹽酸標準溶液滴定，溶液由藍綠色變成灰紅 色為終點。得消耗鹽酸標液 V1（mL）,滴定的結果用空白實驗校正。7. 另稱取樣品 m2克（約 0.5 至 1 克），用步驟 5 相同的方法定氮，得消耗鹽酸標液 V2（mL）,滴定的結果用空白實驗校正。氯乙酸氮溶指數的測疋氯 乙 酸 氮 溶指 數 的 測 疋四.計算公式1 三氯乙酸氮溶指數(TCA-NSI )按式(1)計算：TCA-NSI(%)= (Vi-Vo)xm2X75)/ (V2-Vo)xmiX12.5)X100(1)式中：mi-測定可溶性氮時稱取的試樣質量，g;m2-測定總氮時稱取的試樣質量，g;Vo-空白試驗消耗的鹽酸標準滴定溶液體積，m

7、L;Vi-測定可溶性氮時消耗的鹽酸標準滴定溶液體積，mL;V2-測定總氮時消耗的鹽酸標準滴定溶液體積，mL;2.允許誤差每個試樣取兩平行樣進行測定，以算術平均值為結果。兩次平行測定結果絕對差值不大于 3%。備注產品檢測前提條件：不含非蛋白氮、游離氨基酸3%得到三氯乙酸氮 溶指數才精確。質量部技術總監總經理二 關于富力肽中小肽含量的確定：11檢測方法：三氯乙酸氮溶指數(TCANSI)12原理：三氯乙酸是一種蛋白質沉淀劑，它可以沉定蛋白質和較長 的肽段。隨著酶解反應的進行， 蛋白質的肽鏈逐漸被切成大小不 等的片段，三氯乙酸氮溶指數提高。因此，三氯乙酸氮溶指數可 以準確地反應蛋白質的酶解情況， 溶解

8、指數越高， 表明小肽的含 量越高。13方法：見標準。14富力肽中小肽含量的確定：采用上述方法進行檢測，可以確定富力肽中的小肽含量。在富力肽的全部蛋白類物質中小肽的含量為65%。 在富力肽的水溶性蛋白類物質中小肽的含量為98%。三 關于富力肽中小肽分子量譜的確定：21檢測方法：基質輔助激光解吸附飛行時間質譜( MALDI TOFMass Spectroscopy)22原理：質譜是肽和蛋白質分析的重要工具， 這主要歸功于一些軟 電離技術的應用， 其中最具代表性的即基質輔助激光解吸附電離 (MALDI)。該項技術由于方便、靈敏度高，已成為蛋白質酶解 產物中肽段質量譜分析(Peptide Mass Fingerprinting)的最有效 的工具。MALDITOFMS采用有紫外吸收的小分子晶體為基 質，將待測物與基質結合。然后用一定波長的激光照射，聚集的 能量加熱晶體，使基質晶體升華而將非揮發性的待測物釋放到氣 相中。MALDI主要生成待測物的單電荷離子，送入TOF(Time of Flight)分析儀，測得離子從起始譜到探測端的飛行時間，根 據飛行時間的長短確定分子量的大小， 從而得到一張完整的蛋白