1、細胞污染及處理方法總結潔凈區，并不是沒有細菌，而是細菌的數量非常少， 國家標準100級的潔凈標準是浮游 菌數不得超過5個每立方米，沉降菌數不得超過 1個每培養皿.而國外的標準比我國的還要 高一點，要求的數量更少。所以在我們的潔凈操作臺里，并不是真正一個細菌都沒有的，所以在操作的時候還是要 盡量利索迅速地完成操作。盡量減少進入培養體系細菌的數量。所以處理細菌污染的重要原則就是：無限地稀釋細菌的濃度，無限地減少細菌的數量!、細菌污染培養基：顏色發紅，液體清亮或渾濁;顯微鏡下：有黑點或桿狀物在到處游走，細胞部分脫落，出現細胞碎片;成像:昉-圖一：桿菌污染T-J. I 嚴.'J.-.Jf J.

2、圖二：白色鏈球菌以下是摘自丁香園的處理方法:1).將污染的培養液倒掉，轉燒瓶口，加入 10mlPBS適當晃動清洗培養瓶，然 后倒掉。轉燒瓶口。2)3).繼續加入10mlPBS同樣方法晃動，清洗培養瓶，然后倒掉。.繼續加入5mlPBS同樣方法洗瓶，主要是培養面，然后倒掉。4).重復步驟3再洗。5).重復步驟3再洗。6)7).加入3-5ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。.加入3ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。8).再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。2ml雙抗。9).加入10ml培養液，加入2ml雙抗，放置培養箱培養，5小時之后，倒掉培 養基，加入PBS洗瓶兩次，然后加入胰酶消化，

3、吹打后置于離心機800-1000r/min 離心，然后洗一次。置于新的培養瓶里培養，培養體系加入10) .24h之后，視情況換液，若仍然污染嚴重，培養基渾濁，重復以上步驟， 若看不到污染物，則繼續步驟1)、3)、4)、6)、8)，然后加入培養液培養,培養體系加入2ml雙抗.11） .24h之后，若仍污染嚴重，可再重復一次，若還污染只能棄之（不過一般 沒有出現這種情況），若鏡下不見污染物，則換液PBS洗瓶，正常培養。（常見為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）若細胞狀態極差，盡早處理掉細胞，并找出污染源，對培養箱，生物安全柜，細 胞房進行消毒處理。二、真菌污染培養基：有的培養液清亮，不變色;顯微鏡下：有絲

4、狀物，有些真菌開始很像死細胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細 菌那么容易被發現，但是一旦發現有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了。成像:/ -X"7更圖三：看上去像白色念珠菌污染r-處理方法：若為霉菌或者真菌污染,（在30卩g/ml時會有細胞毒性）加入兩性霉素。另外也可以選擇在培養基里加B清洗和培養，終濃度一般為2.5卩g/ml3ug/ml的制霉菌素或放線菌素D。其它操作同細菌。二、霉菌污染培養基：培養液是清亮的;顯微鏡下：絮狀雜質，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細胞仍可生長,但

5、時間長之后，細胞的活力狀態變差； 成像:處理方法：預防霉菌污染，可在培養基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；（原來我們這里也有霉菌感染的，不過后面在培養基里加上了0.5 %的大福康（原來的雙抗各改為0.25 %的青霉素和鏈霉素）摘自丁香園），效果還可以！你可以試試！ ！但 細胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補，建議舍棄該污染細胞。，將環境徹底消毒，如果所有細胞都污染，可能是系統污染，檢查一下培養基和器材， 如果只是個別污染，可能是操作問題，就要注意操作 霉菌污染多來自空氣，所以做實驗時說話聊天，或瓶口敞開時間太長，還有培養箱開關頻繁是 主要原因，還是

6、多找自身原因.四、支原體污染支原體污染后，不會立即使細胞死亡，可以與細胞長期共存， 培養基一般不發生渾濁， 細胞 無明顯變化，外觀上給人以正常感覺， 實則細胞收到多方面潛在影響， 如引起細胞變形， 影 響DNA合成，抑制細胞生長等。培養基：可能無明顯表現;顯微鏡下：慢慢會使細胞狀態變差，生長變慢，在顯微鏡下觀察可能會有小黑點，但培養基一般不發生 渾濁。細胞傳代以后就出現細胞間黑點，細胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的 細胞，最終細胞漂浮，完全死亡。細胞生長緩慢，或者出現無明顯誘因脫落，凋亡，細胞碎 片增多，有的甚至只表現為細胞狀態日漸不佳。成像: 處理方法：采用支原體清除劑，有同學說用泰樂處理支原

7、體污染效果比較好。用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細胞培養，無任何不良反應。Sigma公司的使用時用 50ug/mlTylosin培養液培養6天或連續傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話，建議用8ug/ml的濃度。般處理起來比較復雜，因此多放棄細胞重新培養。五、黑膠蟲污染培養基：可能無明顯表現，或液體顏色異樣 顯微鏡下：大量黑點原地震動，與細菌污染相鑒別，細胞狀態不佳。有的因細胞密度較高, 或細胞增殖較快，細胞代謝產物增多，要注意鑒別。成像: 處理方法：黑膠蟲在科研領域還是很未知的啊。所以沒有什么好的應對方法。預防為主！ 還是要強調無菌操作啊！尤其注意血清的質量！這個是主要

8、來源。一般建議用北美血清, 這個黑膠蟲污染會概率小。六、原蟲污染培養基：培養液可輕微渾濁顯微鏡下：細小的點狀物數量非常多， 輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢， 而且細胞狀態不好， 邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。這 種共生是非常普遍的， 但他們的數量小，細胞占優勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長，最終形成惡性循環。成像: 處理方法:在操作的過程中，一定要小心操作動作，輕柔緩慢，切忌大動作魯莽。防止細胞脫落。這個拯救細胞還是主要針對無路可退的時候。污染還是重在預防！ ！細胞房 培養箱每兩周更換一次水（高壓過的雙蒸水），條件允許的每兩周可以用酒精擦洗一遍培養箱;地面每兩到三天用新潔爾滅拖