1、 醫學微生物學與免疫學實驗 實驗目的和要求一、實驗前務必做好預習，明確實驗目的、內容及理論依據等，避免或減少錯誤的發生，以保證實驗在預期內完成。二、實驗操作嚴格按要求進行，嚴防污染和感染。三、對示教實驗聯系理論認真觀察。對光鏡下標本不得擅自挪動視野，其他示教標本看后必放回原處。對錄像教學應作重點、簡要的筆記。四、客觀真實地記錄實驗結果并進行分析，若與理論不符，要加以分析討論，找出原因，必要時重復實驗。五、在規定時間內完成實驗報告，報告要求字跡清楚，說明問題簡單扼要。 實驗室規則1. 非實驗必需品禁止帶入實驗室。2. 穿白大衣，按規定就坐。3. 實驗室應保持安靜和良好的秩序，不得高聲談笑、亂動物

2、品或隨便走動。4. 實驗室內嚴禁吸煙、進食、飲水或用嘴濕潤鉛筆和標簽等，也不要用手搔抓撫摸機體。5. 實驗時若不慎發生皮膚創傷，或病原菌污染衣物、卓（地）面等事故，應立即報告指導老師，進行緊急處理。6. 實驗所用的玻片、試管、吸管等，用后應隨即投放盛有消毒劑的指定容器內，不得放在桌上，也不可在水池中沖洗。7. 每次實驗完畢，按實驗要求應及時清理實驗物品，清掃衛生；離開實驗室時，消毒洗手后離開實驗室；對白大衣經常清洗消毒。 油鏡的使用和維護目的：掌握油鏡的使用與維護，熟悉油鏡的使用原理。材料：顯微鏡，拭鏡紙，液體石蠟油，二甲苯原理：油鏡的透鏡極小，工作焦距最短，光線通過玻璃和空氣，由于介質密度不

3、同發生折射，射入鏡筒的光線極少，視野暗，物象不清晰。如在玻片與鏡頭（透鏡）之間加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可減少光線的折射，加強視野的亮度，獲得清晰的物象。步驟：顯微鏡油鏡的使用和維護1.將顯微鏡平穩地安放在實驗臺適宜處。識別油鏡頭：標有100×、OIL、HI等字樣。2. 打開電源，用低倍鏡對光，打開光圈，調節聚光鏡的位置，使視野光線充足。3. 標本上加鏡油一滴，轉動粗螺旋，使油鏡頭緩緩下降，用眼從側面觀察，直到油鏡頭浸入油中接近玻片為止。 4. 從目鏡觀察，同時徐徐轉動粗螺旋提升，見模糊物象后再用細螺旋調節，直到見到清晰物象為止。5. 觀察完畢，

4、粗螺旋提高鏡頭，取下標本片，油鏡頭使用后立即用擦鏡紙擦凈鏡頭上的油。如油已干，可在擦鏡紙上滴少許二甲苯擦拭，并立即用另一擦鏡紙擦去二甲苯，因二甲苯能溶解鏡頭上的固定膠以致使鏡頭脫落。6.將鏡頭轉呈“八”字，調低聚光器，對號送入柜子內存放。 革蘭染色目的：掌握革蘭染色的原理及操作。材料：干凈玻片，接種環，葡萄球菌和大腸桿菌18-24h培養后的混合菌液，酒精燈，一套革蘭染液原理：主要為細胞壁結構的差異。G+三維肽聚糖結構的交聯度大，通透性低，脂質少或無，酒精作用使孔徑縮小；而G-肽聚糖為二維疏松結構，薄，外膜含大量脂質，易被酒精溶解，使細胞壁通透性增高，結晶紫-碘復合物被酒精溶解而脫色。步驟：1.

5、 細菌標本的制作（1）涂片：無菌操作。取一接種環混合細菌懸液，涂布成直徑約1cm的涂片，涂片應薄而均勻。（2）干燥：涂片最好在室溫中自然干燥。必要時可將標本面向上，放在酒精燈上方微火處干燥。（3）固定：標本面向上，在酒精燈火焰外焰按鐘擺的速度來回通過3次，放置待冷后染色。固定的目的是殺死細菌，使細菌與玻片黏附較牢固。菌體蛋白質變性后，提高與染料的親和力。2. 革蘭染色 （1）初染：滴加結晶紫染液1-2滴于涂片上，1min鐘后用自來水緩緩沖洗。（2）媒染：滴加碘液1-2滴，1min后用自來水緩緩沖洗。（3）脫色：加95%酒精數滴，擺動玻片使酒精與細菌充分接觸，約20-30s后，立即用自來水緩緩沖

6、洗。（4）復染：滴加稀釋碳酸品紅液，30-60s后，自來水緩緩沖洗。用吸水紙吸干后，用油鏡觀察。鏡檢后，載片放入消毒缸。 細菌特殊結構的觀察目的：觀察并掌握細菌的形態及特殊結構。材料：細菌鞭毛、芽孢、莢膜的標本片；革蘭陽性菌、革蘭陰性菌染色標本片示教：革蘭陽性菌：葡萄球菌，紫色革蘭陰性菌：大腸桿菌，紅色細菌鞭毛細菌芽孢細菌莢膜 細菌的分布目的：了解細菌在自然界中的分布情況。材料： 普通瓊脂平板培養基、血平板、鑷子、無菌棉拭子、革蘭染液。操作步驟：1.空氣中細菌的檢查（1）采用沉降法：取普通瓊脂平板培養基1只，任意置一處，啟蓋約15分鐘，再蓋上，37培養24小時，觀察有無細菌生長。 （2）結果判

7、定：培養基表面可見多種大小、形態不一的菌落。2. 皮膚表面細茵檢查(1)采用涂抹法: 先在平板底面用記號筆分成兩區，作標記，將未消毒的手指在平板的12處表面輕輕涂抹劃線，然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮膚，用消毒后的手指在平板另一12處進行涂抹，操作完畢，置37培養24小時后，取出觀察結果。(2)結果判定：培養基表面有幾種大小及形態不同的菌落生長，注意比較消毒前后細菌的生長情況。 3.咽喉部細茵檢查(1)用無菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，并劃線分離，37oC培養24小時后觀察結果。注意觀察平板上菌落種類以及是否有溶血現象，并可挑取菌落進行革蘭染色檢查。口腔微生物檢查也可用無菌牙簽直接挑取少量

8、牙垢，制成涂片，進行革蘭染色檢查。(2)結果判定：血平板表面有大小和形態不同的菌落，有的菌落周圍可見溶血環。牙垢涂片鏡檢可見革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。 紫外線殺菌實驗目的：掌握紫外線殺菌的原理，熟悉紫外線殺菌實驗的操作。材料：大腸桿菌，瓊脂平板，無菌回形狀紙片，接種環，鑷子，紫外燈.原理：紫外線波長范圍為240280nm,最適的波長為260nm，這與DNA吸收光譜范圍相一致。其殺菌原理是紫外線易被核蛋白吸收，使DNA的同一條螺旋體上相鄰的堿基形成胸腺嘧啶二聚體，從而干攏DNA的復制，導致細菌死亡或變異。紫外線特點：紫外線的穿透能力弱，不能通過普通玻璃、塵埃。步驟：1.平板密集劃線接種。2.在平板

9、上貼無菌回形紙片。3.UV照射30min（打開平板蓋子）。4.取出回形紙，將回形紙放入消毒缸中。5.37培養24h后觀察結果。 培養基配制目的：掌握細菌生長的營養成分。熟悉培養基的配制。材料：培養基配制的原材料示教：培養基配制過程。 細菌代謝產物觀察和生長現象目的：掌握細菌代謝產物的檢測和結果的判斷。熟悉細菌在各種培養基中的生長現象。材料：各種生化管，大腸桿菌、傷寒桿菌、產氣桿菌、變形桿菌等。原理：不同菌的酶系統不同，對底物的代謝產物也不同，用生化的實驗方法可將產物檢測出來，從而對細菌鑒定。步驟：一、細菌代謝產物觀察1. 糖發酵實驗 將大腸桿菌、傷寒桿菌分別接種在葡萄糖發酵管內，37培養18-

10、24h進行觀察。培養基中指示劑為溴甲酚紫。如能分解葡萄糖，則產酸，培養基由原來的紫色變為黃色，記錄符合為“+”。如同時還產生氣體，則其中倒置的小管中有氣泡出現，記錄符合為“”。如能分解乳糖，則產酸，培養基由原來的紫色變為黃色，記錄符合為“+”。如同時還產生氣體，則其中倒置的小管中有氣泡出現，記錄符合為“”。如培養基未變色，仍為紫色，則表明細菌不能分解乳糖不能分解乳糖。記錄符合“-”。2.枸櫞酸鹽利用實驗該培養基中提供的唯一碳源是枸櫞酸鈉。指示劑是澳麝香草酚蘭。分別接種大腸桿菌和產氣桿菌，37培養24h進行觀察.若斜面有菌落出現，培養基由原來的綠色變為深蘭色，表明細菌能利用枸櫞酸鈉，記錄符合“+

11、”，反之“-”。3.靛基質吲哚產生實驗能產生色氨酸酶的細菌，可分解蛋白胨水培養基中的色氨酸，產生靛基質。將大腸桿菌和產氣桿菌分別接種在蛋白胨水培養基中，37培養48h后，每管各加吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛）3-4滴，若出現紅色化合物-玫瑰色吲哚，表明靛基質產生陽性“+”；反之為陰性：“-”。4. 硫化氫產生實驗有的細菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）產生硫化氫。將大腸桿菌和變形桿菌分別接種在這樣的培養基中，37培養18-24h。若培養基中出現黑色沉淀物即為陽性“+”，表明產生的硫化氫與培養基中的鉛鹽(或鐵鹽)結合，生成黑色的硫化鉛（或硫化鐵）。二、細菌生長現象1、在液體培養基上生長情況

12、(1)表面生長：液體清晰，細菌生長在液面形成菌膜。如枯草桿菌。 (2)混濁生長：液體均勻混濁，或有少量沉淀。如大腸埃希菌。 (3)沉淀生長：液體清晰，細菌生長在管底，形成沉淀。如鏈球菌。2、在固體培養基上的生長情況 (1)菌苔：在瓊脂斜面培養基上長成菌苔。(2)菌落：在平板上形成肉眼可見的細菌集團，稱為菌落。觀察時要注意菌落的大小、形狀、表面形狀、邊緣是否整齊、透明度、顏色等，可作為鑒別細菌的依據之一。(3)色素：水溶性色素和脂溶性色素。3、在半固體培養基上的生長情況 有鞭毛的細菌，由于能運動，在半固體培養基內沿穿刺線彌漫性生長，使穿刺線變得模糊不清。無鞭毛的細菌，因為不能運動，接種生仍沒穿刺

13、生長，穿刺線與周圍界限清楚。 高壓蒸汽滅菌目的：掌握高壓蒸汽滅菌的原理及應用范圍，了解高壓蒸汽滅菌的操作。材料：高壓蒸汽滅菌器。原理：高壓蒸氣滅菌器是一種堅固密閉的蒸鍋，鍋蓋上裝有壓力計、安全閥及排氣孔等。鍋蓋密閉旋緊后由鍋底加熱，因蒸氣不能外溢，可使鍋內壓力逐漸增高，從而提高了鍋內水的沸點和蒸氣的溫度。由于高壓蒸氣的溫度較高，放出潛熱多，熱力穿透能力較強，故其滅菌效能最好。凡能耐熱和耐潮濕的物品如培養基、生理鹽水、紗布、玻璃器材等都可以應用此法消毒滅菌。講解（示教）高壓蒸汽滅菌器的主要構件：一個能密閉的耐高壓的雙層金屬圓筒，蒸汽壓力計，安全閥，排氣閥等。步驟：1.先向外筒注入一定量水，需滅菌

14、物品裝入內筒，不宜擁擠，以便蒸汽充分回旋。把筒蓋擰緊蓋嚴，打開排氣閥，開始加熱。2. 水沸騰后，排氣閥打開排出氣體，待排氣孔急促排出蒸汽，表明冷空腔已排盡，關閉排氣閥，此時筒內壓力逐漸上升。3. 待壓力達到所需值時，適時調節熱源，使維持一定時間。一般為15磅，溫度121.3，維持15-30min。4. 滅菌達到所需時間后，關閉熱源，自然降壓（溫），待壓力表指針降至“0”時，方可開蓋取物。注意事項：1.器內的水量適當。2.放入的物品不擁擠。3.排盡冷空氣。4. 待壓力表指針降至“0”時，方可開蓋。 凝集實驗（玻片法）目的：掌握抗原抗體反應的基本原理和特異性，熟悉凝集反應的操作。材料：傷寒桿菌AF

15、群O多價血清、志賀氏痢疾多價血清、生理鹽水、未知菌、玻片。原理：顆粒性抗原（凝集原）與相應的抗體（凝集素）直接結合，在一定的條件下形成肉眼可見的凝集現象。如紅細胞ABO血型的測定，測定細菌的細菌凝集實驗。步驟：1.取清潔載物玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號碼。于第一格和第二格內各加約30ul傷寒桿菌AF群O多價血清及志賀氏痢疾多價血清，第三格內滴加約30ul生理鹽水。2. 用接種環挑取待檢菌種少許，分別均勻地涂抹于1、2、3格內的液體中。接種環每次使用前后均需經酒精燈火焰燒灼滅菌。3. 輕輕搖動玻片，數分鐘后用肉眼觀察結果，出現灰白色凝集顆粒者即為陽性反應；仍為均勻混懸液者為陰性反應。如結果

16、不夠清晰，可將玻片放于低倍顯微鏡下觀察。 沉淀反應（雙擴散）目的：掌握抗原抗體反應的基本原理和特異性，熟悉沉淀反應的操作。材料：干凈玻片，玻璃蠟筆、打孔器、微量加樣器、正常人血清IgG、羊抗人IgG原理：將抗原與抗體分別加到電解質凝膠板相鄰的兩孔中，抗原與抗體雙方自由擴散，在最適當比例處形成抗原抗體復合物（沉淀線）。步驟：1.制板：取干凈玻片一片，用蠟筆分為三格，用吸管將45ml加熱溶化的1.5%食鹽瓊脂充盈中格，制備瓊脂板。2. 打孔：待瓊脂板凝固后，用打孔器打孔。孔間距約為5mm。3. 封底：將打好孔的瓊脂板凝板過火焰三次。4. 加樣：用微量加樣器在三孔中加入生理鹽水，正常人血清IgG和馬

17、抗人IgG。每孔加入約10l。注意：加樣時勿使液體溢出和孔內出現氣泡。5. 擴散：將瓊脂板放入濕盤內，置37溫箱中（均保持水平位置），于24小時后觀察結果。 ELISA（乙肝病毒表面抗原的檢測）目的：掌握ELISA的原理，用途，熟悉其操作過程。材料：乙肝病毒表面抗原的檢測試劑盒、待檢血清、微量加樣器等。原理：將酶與抗體（或抗原）用交聯劑結合起來，此種酶結合物能與相應的抗原（或抗體）發生特異性結合反應，形成酶-抗原抗體大分子復合物，此時再加入酶底物，底物被酶催化生成有色產物，最后借助反應體系的顏色變化及呈色深淺來推斷樣品中檢測對象的有無或含量。步驟：1加待檢患者血清：0.05ml /孔，并設HB

18、sAg陽性對照2孔，HBsAg陰性對照2孔，空白對照1孔。2加HBsHRP：0.05ml /孔，空白對照不加，充分混勻，置37 30min。3洗板：棄去反應板孔內液體，拍干；用洗滌液注滿各孔，靜置510sec，棄去孔內洗滌液，拍干，如此反復5次，拍干。4加顯色劑：先加顯色劑A，0.05ml /孔；再加顯色劑B，0.05ml /孔；充分混勻，置37 避光15min。5終止反應：每孔加終止液0.05ml /孔，混勻。6測定：1）目測法：與陽性和陰性對照比較，觀察顏色深淺作出判斷2）用酶標儀讀取各孔OD值。 藥敏實驗(紙片法)目的：掌握紙片法藥敏實驗方法，熟悉微生物培養，了解抗生素對細菌的作用機制。

19、了解含藥紙片的制備材料：大腸埃希菌，普通瓊脂培養基，無菌鑷子，打孔器(直徑6cm)，抗生素紙片。原理：藥物在瓊脂上擴散，形成濃度涕度，在一定的濃度下，對細菌抑制或殺死，濃度過低，則不能抑制或殺死。從而形成一定大小的抑菌圈。步驟：1.平板上密集劃線接種。2.貼4-5種含抗生素的紙片于平板上。藥片與平板邊緣相距至少1.5cm，藥片之間相距至少2cm。3. 37培養24h后觀察結果。測量抑菌圈直徑大小，判斷敏感性。 消毒劑對細菌的影響目的：掌握含藥紙片的制備。熟悉微生物培養，了解消毒劑對細菌的作用機制。材料：大腸埃希菌，普通瓊脂培養基，無菌鑷子，打孔器(直徑6cm)，濾紙紙片(直徑約6 mm)，70

20、%酒精，金星消毒水，紫藥水、紅藥水。原理：藥物在瓊脂上擴散，形成濃度涕度，在一定的濃度下，對細菌抑制或殺死，濃度過低，則不能抑制或殺死。從而形成一定大小的抑菌圈。步驟：1.平板上密集劃線接種細菌。2. 將無菌干燥的濾紙片放入各種消毒劑中浸濕，在容器邊緣瀝干，即為含藥的濾紙片。3. 將以上含藥濾紙片貼于平板上，每塊貼4種。藥片與平板邊緣相距至少1.5cm，藥片之間相距至少2cm。4. 37培養24h后觀察結果。測量抑菌圈直徑大小，判斷抑菌效果。 口服藥物的微生物檢查目的：掌握口服藥物的微生物檢查指標,熟悉其操作過程。一、細菌總數檢測材料：待檢中成藥片劑或丸劑，吸管、燒瓶、研缽、普通瓊脂培養基、無

21、菌生理鹽水、試管、平板。步驟：1.稱取一定量待檢藥物置于無菌研缽中，加入無菌生理鹽水研磨，制成均漿，然后移入燒瓶內加足生理鹽水，使之濃度成為1：10的均勻懸液。2. 用1ml吸管吸取1：10藥液1ml加入裝有9ml的無菌生理鹽水的試管內，得到1：100稀釋液。依次在一排管內作10倍遞增稀釋。得到10-1、10-2、10-3、10-4等不同濃度的稀釋液。3. 選擇適宜的幾個稀釋度進行測定 用1ml無菌吸管分別吸取所選濃度的各種稀釋液加入到直接9cm的無菌平板中。每種濃度做3個平板，每個平板中加入1ml的稀釋藥液。將融化并冷卻至50的瓊脂培養基15ml倒入平板中，并立刻轉動平板使藥液和培養基充分混

22、勻。冷卻后的平板翻轉，置37培養24-48h,取出計算每一平板中生長的菌落數，并求得每一稀釋度的3個平板的菌落均數。4.細菌總數報告 選取菌落平均數值在30-300個之間的平板作為菌落總數測定范圍。將數得的菌落均數乘以相應稀釋度即得到每克或每毫升監測藥品中的細菌總數。 稀釋度的選擇：1.若只有一個稀釋度，菌落均數在30-300個間，即乘以稀釋倍數報告（見表中例I）。2.若兩個稀釋度，菌落均數都在30-300個間，則求出兩者每克或每毫升總均數之比，若比值小于2應報告其均數，若大于2則報告較多的數值（見表中例、）。3. 若所有稀釋度菌落均數多大于300個，取稀釋度最高的菌落均數乘以稀釋倍數報告（見

23、表中例）。4.若所有稀釋度菌落均數均少于30個，取稀釋度最低的菌落均數乘以稀釋倍數報告（見表中例）。5. 若所有稀釋度菌落均數不在30-300個之間，一個稀釋度大于300個，相鄰另一稀釋度小于30時，則以接近30-300個的菌落均數乘以稀釋倍數報告（見表中例）。 細菌計數結果及報告方法 菌落均數 稀釋倍數 比值 菌落總數 報告方式 例次 10-1 10-2 10-3 (個/克或ml) (個/克或ml) 1365 164 20 - 16400 16000/1.6×104 2760 295 46 1.6 37750 38000/3.8×104 2890 271 60 2.2 2

24、7100 27000/2.7×104 不可計 4650 513 - 513000 510000/5.1×105 27 11 5 - 270 270/2.7×102 不可計 305 12 - 30500 31000/3.1×104二、霉菌總數的測定材料：待檢中成藥片劑或丸劑，吸管、燒瓶、研缽、馬丁培養基、無菌生理鹽水、試管、平板。步驟：1.稱取一定量待檢藥物置于無菌研缽中，加入無菌生理鹽水研磨，制成均漿，然后移入燒瓶內加足生理鹽水，使之濃度成為1：10的均勻懸液。2. 用1ml吸管吸取1：10藥液1ml加入裝有9ml的無菌生理鹽水的試管內，得到1：100稀

25、釋液。依次在一排管內作10倍遞增稀釋。得到10-1、10-2、10-3、10-4等不同濃度的稀釋液。3. 取適宜稀釋度的稀釋液各1ml，分別加入無菌平板中，每個稀釋度各做3個平板。4. 將15ml融化并冷卻至50的內含4/30000虎紅的馬丁培養基倒入平板中，充分混勻、凝固。5. 將平板倒置，置25-28培養72h。計算平板內染成粉紅色的霉菌菌落均數（如有根霉或毛霉生長，因其能蔓延生長而掩蓋了其他菌落，應及時取出計數以免影響結果）。6. 真菌的菌落計數時，先點清每個平板上生長的菌落數，再求出每一個稀釋度的菌落平均數。判斷結果時選取均值在5-50個范圍以內的菌落數乘以相應稀釋倍數后，作為真菌總數報告。若有兩個稀釋度的菌落均數皆在5-50個以內，或3個稀釋度的菌落均數皆不在此范圍內時，稀釋度的選擇可參照細菌總數測定時的稀釋度選擇規則。即以細菌菌落均值30-300個相對應于真菌菌落均值5-50個作為選擇稀釋度的參考標準。例如兩個稀釋度的真菌菌落均值都在5-50個范圍內，稀釋度選擇可參照上面表中的例、例。 外用藥物的微生物學檢測目的：掌握外