1、三代基因組測序技術原理簡介摘要：從1977年第一代DNA測序技術Sanger法1,開展至今三十多年時間,測序技術已取得了相當大的開展,從第一代到第三代乃至第四代,測序讀長從長到短,再從短到長.雖然就當前形勢 看來第二代短讀長測序技術在全球測序市場上仍然占有著絕對的優勢位置,但第三和第四代測序技術也已在這一兩年的時間中快速開展著. 測序技術的每一次變革,也都對基因組研究,疾病醫療研究, 藥物研發, 育種等領域產生巨大的推動作用.在這里我主要對當前的測序技術以及它們的測序原理 做一個簡單的小結.口、居環灣 ft柏虐 ?I卻卜帶tdOMTF 35杵網 門口渣干住HdisctifN：HluminJi

2、(2WI4)Single molecute 艮 al DlF'MKT (Ml 吟忖到口內隅Ilhi IXiM cirioii圖1:測序技術的開展歷程生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學的研究有著十分重要的意義.以上圖 1所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結構以來,整個測序技術的開展歷程.第一代測序技術第一代DNA測序技術用的是1975年由桑格Sanger和考爾森Coulson開創的鏈終止法或者是1976-1977年由馬克西姆 Maxam和吉爾伯特Gilbert創造的化學法鏈降解,并在1977年,自此,人類獲得了窺探生命桑格測定了第一個基因組序列,是噬菌體 X174的,

3、全長5375個堿基遺傳差異本質 的水平,并以此為開端步入基因組學時代. 研究人員在Sanger法的多年實踐之中不斷 對其進行改良.在2001年,完成的首個人類基因組圖譜就是以改良了的Sanger法為其測序根底,Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2'和3'都不含羥基,其在DNA的合成過程中不能形成磷酸 二酯鍵,因此可以 用來中斷DNA合成反響,在4個DNA合成反響體系中分別參加一定比例帶有放 射性同位素標記的ddNTP 分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP,通過凝膠電泳和放射自顯影后 可以根據電泳帶的位置確定待測分子的 DNA序列圖2.這個性此為sange

4、r測序法制作了一個小 短片,形象而生動.值得注意的是,就在測序技術起步開展的這一時期中,除了 Sanger法之外還出現了一些其他的測序 技術,如焦磷酸測序法、鏈接酶法等.其中,焦磷酸測序法是后來 Roche公司454技術所使用的測 序方法24,而連接酶測序法是后來 ABI公司SOLID技術使用的測序方法2,但他們的共同核心手段 都是利用了 Sanger1中的可中斷DNA合成反響的dNTP.DC Frd Singer FrMfrT wm awarded fheS b&lt J95S dind 195Q He H the jfonFf力 k*3ft 耐 巾時ghaw beenMob制o向

5、油聲 otjf 晝"91 to wm* both m chfffirfitrytt am1 T «- T Gi I H r C.Ba,*iD F C JiiM4UWbC« EMM. tib-vkd! h-yw-dwrB CME. lr«m bvnom tel tap'didieow* wq,trfncr| t«hnique且r M al/ IS 77)圖2: Sanger法測序原理第二代測序技術總的說來,第一代測序技術的主要特點是測序讀長可達1000bp,準確性高達99.999%但其測序成本高,通量低等方面的缺點,嚴重影響了其真正大規模

6、的應用.因而第一代測序技術并不是最理想的測序方法.經過不斷的技術開發和改良, 以Roche公司的454技術、illumina公司的Solexa, Hiseq 技術和ABI公司的Solid技術為標記的第二代測序技術誕生了.第二代測序技術大大降低了測序本錢的同時,還大幅提升了測序速 度,并且保持了高準確性,以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間,而使用二代測序技術那么僅僅需要 1周,但在序列讀長方面比起第一代測序技術那么要短很多.表1和圖3對第一代和第二代測序技術各自的特點以及測序本錢作了一個簡單的比擬5,以下我將對這三種主要的第二代測序技術的主要原理和特點作一個簡單的介紹.First Gone

7、 rationSequencirigSecund Genest onSequencing10-：10'-圖3.測序本錢的變化1. IllumineIllumina公司的Solexa和Hiseq應該說是目前全球使用量最大的第二代測序機器,這兩個系 列的技術核心原理是相同的2,4.這兩個系列的機器采用的都是邊合成邊測序的方法,它的測 序過程主要分為以下4步,如圖4.(1) DNA待測文庫構建利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段,目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之 外,主要是打斷成200-500bp長的序列片段,并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭,構建出單鏈DNA文庫.(2) Fl

8、owcellFlowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道,當文庫建好后,這些文庫中的DNA在通過flowcell 的時候會隨機附著在 flowcell外表的channel上.每個Flowcell有8個channel,每個channel 的外表都附有很多接頭,這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對(這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因),并能支持DNA在其 外表進行橋式PCR 的擴增.(3) 橋式PCR擴增與變性橋式PCR以Flowcell外表所固定的接頭為模板,進行橋形擴增,如圖 4.a所示.經過不 斷 的擴增和變性循環,最終每個 DNA片段都將在各自的位置

9、上集中成束,每一個束都含有單 個DNA模板的很多分拷貝,進行這一過程的目的在于實現將堿基的信號強度放大,以到達測序所需的信號要求.(4)測序測序方法采用邊合成邊測序的方法.向反響體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4中dNTP 如同Sanger測序法.這些dNTP的3' -OH被化學方 法所保護,因而每次只能添加一個 dNTP.在dNTP被添加到合成 鏈上后,所有未使用的游 離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉.接著,再參加激發熒光所需的緩沖液,用激光激發熒 光信號,并有光學設備完成熒光信號的記錄,最后利用計算機分析將光學信號轉化為測序堿基.這樣熒光信號記錄完成后

10、,再參加化學試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3' -OH保護基團,以便能進行下一輪的測序反響.Illumina的這種測序技術每次只添加一個 dNTP的特 點能夠很好的地解決同聚物長度的準確測量問題,它的主要測序錯誤來源是堿基的替換,目前它的測序錯誤率在1%-1.5%L問,測序周期以人類基因組重測序為例,30x測序深度大約 為1周.iPrpirc genomic. DNA sampleRaridciniiy fra-gment z5nomir CftA 廿旬 明就皂看的博50加也的 S* frigmsnu.3M ffagnwitRfp at為nOil pnAtUch IDINA tviu

11、rface或地匚皿itid部1 11Bnd single-stranded frag menti iahc ninly to the mside mrf«.E d thtflsw cdl dhmnfksmp喻MienAdd nucleocldH ind 看必THE W iniiLiME! 3口制 |tii» bndgn 即中 li&tiofiFirst chemistry cycle: d«tv r mi n« first bas«To initiate the firs： 速qurncrigcyde 第d a I foured r的足

12、網甲leiininator, primer and DhA polymerase enzyme to the thw ctl.GImage of first chemhlry cycle 岫打后淌 自江過河.飛值piu律Ceinwge of emittec Al ore t« nee from "ch cluster on tFic flow cell. Record the identity d the fint base for each duller.BM.恒 Initiating the next chemi stry cyJe Theblockjed 31 tie

13、rminiit 分旬 the fl joroptwre ffonr exh incorporated 加比 dre reOKA'edSequence read over multiple chemistry cyclesRepeat cycles of wquencing to dettrnnine the stquenaof in 3 given Ngment a bsseal a time, :/blog. esdn. nei/dy Hovc98圖4. Illumina測序流程1. Roche 454Roche 454測序系統是第一個商業化運營二代測序技術的平臺.它的主要測序原理是

14、圖 52abc:（1） DNA文庫制備454測序系統的文件構建方式和illumina的不同,它是利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp 長的小片段,并在片段兩端加上不同的接頭,或將待測 DNA變性后用雜交引物進行PCR擴增, 連接載體,構建單鏈DNA文庫圖5a.（2） Emulsion PCR 乳液PCR,其實是一個注水到油的獨特過程454當然DNA擴增過程也和illumina的截然不同,它將這些單鏈 DNA結合在水油包被的直徑約28um的磁珠上,并在其上面孵育、退火.乳液PCR最大的特點是可以形成數目龐大的獨立反響空間以進行DNA擴增.其關鍵技術是“注水到油(水包油),根本過程是在P

15、CR反響前,將包含PCR所有反響成分的水溶液注入到高速旋 轉的礦物油外表,水溶液瞬間形成無數個被礦物油包裹的小水滴.這些小水滴就構成了獨立的PCR反響空間.理想狀態下,每個小水滴只含一個 DNA模板和一個磁珠.這些被小水滴包被的磁珠外表含有與接頭互補的DNA序列,因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結合在磁珠上.同時孵育體系中含有 PCR反響試劑,所以保證了每個與磁珠結合的小片段都能 獨立進行PCR擴增,并且擴增產物仍可以結合到磁珠上.當反響完成后,可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來.進過擴增,每個小片段都將被擴增約100萬倍,從而到達下一步測序所要求的DNA量.(3)焦磷酸測序測序前需

16、要先用一種聚合酶和單鏈結合蛋白處理帶有 DNA的磁珠,接著將磁珠放在一種 PTP平 板上.這種平板上特制有許多直徑約為 44um的小孔,每個小孔僅能容納一個磁珠,通過這種方 法來固定每個磁珠的位置,以便檢測接下來的測序反響過程.測序方法采用焦磷酸測序法,將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中,啟動測序反響.測序反響以磁珠上大量擴增出的單鏈 DNA為模板,每次反響參加一種dNTP進行合成反響.如果dNTP能與待測序列配對,那么會在合成后釋放焦磷酸基團.釋放的焦磷酸基團會與反響體系中的ATP硫酸化學酶反響生成 ATP.生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反響中的熒光素分 子并發出熒光,同時

17、由PTP板另一側的CCD照相機記錄,最后通過計算機進行光信號處理而獲 得最終的測序結果.由于每一種 dNTP在反響中產生的熒光顏色不同,因此可以根據熒光的顏色來判斷被測分子的序列.反響結束后,游離的 dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解 ATP,從而導 致熒光淬滅,以便使測序反響進入下一個循環.由于454測序技術 中,每個測序反響都在PTP板上獨立的小孔中進行,因而能大大降低相互間的干擾和測序偏差.454技術最大的優勢在于其能獲得較長的測序讀長,當前454技術的平均讀長可達400bp,并且454技術和illumina的Solexa和Hiseq技術不同,它最主要的一個缺點是無法準確測量同聚物的長度,

18、如當序列中存在類似于PolyA的情況時,測序反響會一次參加多個 T,而所參加的T的個數只能通過熒光強度推測獲 得,這就有可能導致結果不準確.也正是由 于這一原因,454技術會在測序過程中引入插入和 缺失的測序錯誤.DNA library preparationA5 hair;LgMSelection (2皿AB Fagnenti engfrag men Led bynebulzadoncloning; no colony picking4 %泗川 itrary creared AithdddptCKSA'Bfrajmr*nb selected ujingavidin-bioiini o

19、urheationgDNA. sstDNA library :/blog. esdn, nct/dyllovc98bEmulsion PCRahouHAimed /iDNAic one也也士 of ONA Cdpture DsJ,Emuk的 bedds dnd PC red yens I r wder-in-oi rttror«actorsCiufidl dmlfiaiKyi ucuursBredk miti 口超出1.1、dndi昌ilk inicrciitdilorinrchfur DNA書04tlvebeads%ENA library> ！,理2那么四網即帥吩;Seque

20、ncing75hcufi> Wdl diameter: average M 44 pm> 400 COO reads obtained in parallel> A 向g他 tio neddirp lifted sstDNA bead is deposited pe科dlAmplified sstDA library beads一 Quality 而忸 red 加5巴圖5. Roche 454測序流程1. Solid 技術Solid測序技術是ABI公司于2007年開始投入用于商業測序應用的儀器.它基于連接酶法,即利用DNA連接酶在連接過程之中測序圖 6 2,4.它的原理是：S

21、OLiD,M substrate丫號.51 Pl 3d«pterTemplate sequence 3rDi base probesy Tannri上上上5,Cleavage site1. Prim« and ligat«Primer round 1享5 . Rep力at 零,1 4 to gvtend »c|U4n(4Li4ition cydt 16 7 (n cydti)6. Primer reset2. Image*h»nnHinl,ni'nrtW, Lnn*mrn«f*mUn versa seq primer (n-l

22、l2. Primer reset / 1 Mok off extended :/ seqyenceUI il3. Cap un«xtended strands7, Repeat steps 1-5 with new primerLl 11111Primer raundll1 base shift隊 Repeat Roy with, n-2, 2, n-4 prtonerRead position gUniverfjl s#q primer 帆-邛UnlverMil prlrriei |n-3)31 HlimillHIHIIUniversall seq pnimer n-4| 3t v

23、wwnwniRnwpunoJ JWEzd7kUni收3|冬爐 gm旺r|n-1JEridge probeBriogeprooeUniversal seq primer ()Bndce probe Indicates positions of interrogation圖6-a. Solid測序技術Glass slice（1） DNA文庫構建片段打斷并在片段兩端加上測序接頭,連接載體,構建單鏈DNA文庫.（2） Emulsion PCRSolid的PCR過程也和454的方法類似,同樣采用小水滴emulsion PCR,但這些微珠比起454 系統來說那么要小得多,只有1um.在擴增的同時對擴增產物

24、的3'端進行修飾,這是為下一 步的測序過程作的準備.3'修飾的微 珠會被沉積在一塊玻片上.在微珠上樣的過程中,沉 積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區域圖6-a.Solid系統最大的優點就是每 張玻片能容納比454更高密度的微珠,在同一系統中輕松實現更高的通量.（3） 連接酶測序這一步是Solid測序的獨特之處.它并沒有采用以前測序時所常用的 DNA聚合酶,而是采用 了連接酶.Solid連接反響的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物,這里將其簡單表示為：3' -XXnnnzzz-5 '.連接反響中,這些探針根據堿基互補規 那么與單鏈DNA模板鏈配對.探 針的5&

25、#39;末端分別標記了 CYS Texas Red CY& 6-FAM這4種顏色的熒光染料圖6-a. 這個8堿基單鏈熒光探針中,第1和第2位堿基XX上的堿基是確定的,并根據種類的不 同在6-8位zzz上加上了不同的熒光標記.這是 Solid的獨特測序法,兩個堿基確定一 個熒光信號,相當于一次能決定兩個堿基.這種測序方法也稱之為兩堿基測序法.當熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時,就會發出代表第 1, 2位堿基的熒光信號,圖6-a 和圖6-b中的比色版所表示的是第1, 2位 堿基的不同組合與熒光顏色的關系. 在記錄下熒 光信號后,通過化學方法在第5和第6位堿基之間進行切割,這樣就能移

26、除熒光信號,以便 進行下一個位置的測序.不過值得注意的是,通過這種測序方法,每次測序的位置都相差5 位.即第一次是第1、2位,第二次是第6、7位在測到末尾后,要將新合成的鏈變性, 洗 脫.接著用引物n-1進行第二輪測序.引物n-1與引物n的區別是,二者在與接頭配對 的位置上相差一個堿基圖6-a. 8.也即是,通過引物n-1在引物n的根底上將測序位置 往3'端移動一個堿基位置,因而就能測定第 0、1位和第5、6位第二輪測序完成,依此 類推,直至第五輪測序,最終可以完成所有位置的堿基測序,并且每個位置的堿基均被檢測了兩次.該技術的讀長在2 X50bp ,后續序列拼接同樣比擬復雜.由于雙次

27、檢測,這一技 術的原始測序準確性高達 99.94%而15x覆蓋率時的準確性更是到達了 99.999%應該說是 目前第二代測序技術中準確性最高的了.但在熒光解碼階段,鑒于其是雙堿基確定一個熒光信號,因而一旦發生錯誤就容易產生連鎖的解碼錯誤.Data wIIectiion and image analysisIdentffybeadsIdentifybead colorGlass slideCollectcolor imageIden tWy beadsColled color imageIdentify bead colorPrimer round 1, legation cycle 1Prim

28、er round 3r ligation cycle 1Primer round 4, ligation cycle 1Primer round 2, ligation cycle 1Color jpace for th i與專eq li總a士uPossible dinuclleotides encoded by each color2nd baseTemplate sequenceDouble interrogationWith 2 bae encod ing ech base is defined twiceADecoding1AAe AA GAPossible dinucleotid&#

29、171;sGC CA CC TCAT TG GG GA I Y Y Yl A T G GACG GTGGAG Base zero ATXl TT CTDecoded sequencesPaCe /助 P :同幅 esdm net/dyll ove98圖6-b. Solid測序技術第三代測序技術 測序技術在近兩三年中又有新的里程碑.以 PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies 納米孔單分子測序技術,被稱之為第三代測序技術.與前兩代相比,他們最大的特點就是單分子測序, 測序過程無需進行PCR擴增.其中PacBio SMRT技術其實也應用了邊合成邊測序的思

30、想 5,并以SMRT芯片為測序載體.根本原理 是：DNA聚合酶和模板結合,4色熒光標記4種堿基即是dNTP,在堿基配對階段,不同堿基的加 入,會發出不同光 根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型.同時這個 DNA聚合酶是實現超長讀 長的關鍵之一讀長主要跟酶的活性保持有關,它主要受激光對其造成的損傷所影響.PacBio SMRT技術的一個關鍵是怎樣將反響信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區別出來.他們利用的是ZMW 零模波導孔原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔.小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會在衍射效應的作用下穿透面板而泄露出來,從而與周圍小孔相互干擾.如果孔徑小于波長,能量不

31、會輻射 到周圍,而是保持直線狀態光衍射的原理,從而可起保護作用.同理,在一個反響管 SMRTCell單分子實時反響孔中有許多這樣的圓形納米小孔,即ZMW零模波導孔,外徑100多納米, 比檢測激光波長小數百納米,激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區,能量被限制在一個 小范圍體積20X 10-21 L里,正好足夠覆蓋需要檢測的局部,使得信號僅來自這個小反響區域,孔外過多 游離核甘酸單體依然留在黑暗中,從而實現將背景降到最低.另外,可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間,來檢測一些堿基修飾情況,既如果堿基存在修飾,那么通過聚合酶時的速度會減慢,相鄰 兩峰之間的距離增大,可以通過這個來之間 檢

32、測甲基化等信息圖7.SMRT技術的測序速度很快, 每秒約10個dNTP.但是,同時其測序錯誤率比擬高這幾乎是目前單分子測序技術的通病,達 到 15%但好在它的出錯是隨機的,并不會像第二代測序技術那樣存在測序錯誤的偏向,因而可以通過多 次測序來進行有效的糾錯.圖7.PacBio SMRT測序原理Oxford Nanopore Technologies公司所開發的納米單分子測序技術與以往的測序技術皆不同,它是基于電信號而不是光信號的測序技術50該技術的關鍵之一是,他們設計了一種特殊的納米孔,孔內共 價結合有分子接頭.當DNA堿基通過納米孔時,它們使電荷發生變化,從而短暫地影響流過納米孔 的電流強度

33、每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的,靈敏的電子設備檢測到這些變化從而鑒定 所通過的堿基圖8.該公司在去年基因組生物學技術進展年會AGBTh推出第一款商業化的納米孔測序儀,引起了科學界 的極大關注.納米孔測序和其他第三代測序技術有望解決目前測序平臺的缺乏,納米孔測序的主要特點是：讀長很長,大約在幾十 kb,甚至100 kb;錯誤率目前介于1陸4%且是隨機錯誤,而 不是聚集在讀取的兩端 數據可實時讀取 通量很高30x人類基因組有望在一天內完成;起始DNA在 測序過程中不被破壞以及樣品制備簡單又廉價.理論上,它也能直接測序RNA.納米孔單分子測序計算還有另一大特點,它能夠直接讀取出甲基化的胞喀呢,

34、而不必像傳統方法那樣對基因組進行bisulfite處理.這對于在基因組 水平直接研究表觀遺傳相關現象有極大的幫助.并且 改方法的測序準確性可達99.8%而且一旦發現測序錯誤也能較容易地進行糾正.但目前似乎還沒有 應用該技術的相關報道._1二后白 a一='圖8,納米孔測序其他測序技術目前還有一種基于半導體芯片的新一代革命性測序技術一一Ion Torrent6o該技術使用了一種布滿小孔的高密度半導體 芯片,一個小孔就是一個測序反響池.當DNA聚合酶把核甘酸聚合到延伸中的 DNA 鏈上時,會釋放出一個氫離子,反響池中的 PH發生改變,位于池下的離子感受器感受到H+離子信號,H+離子信號再直接

35、轉化為數字信號,從而讀出 DNA序列圖9.這一技術的創造人同時也是 454測序技術的創造人之一Jonathan Rothberg ,它的文庫和樣本制備跟454技術很像,甚至可以說就是454的翻版,只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色,而是通過檢測H+信號 的變化來獲得序列堿基信息.Ion Torrent相比于其他測序技術來說,不需要昂貴的物理成像等設備,因此,本錢相對來說會低,體積也會比擬小,同時操作也要更為簡單,速度也相當快速,除了 2天文庫制作時間,整個上機測序可在2-3.5小時內完成,不過整個芯片的通量并不高,目前是 10G左右,但非 常適合小基因組和外顯子驗證的測 序.Frepat

36、eTsmolart* <jn BeMBaseCafenB圖 9. Ion Torrent小結以上,對各代測序技術的原理做了簡要的闡述,這三代測序技術的特點比擬匯總在以下表1和表2中.其中測序本錢,讀長和通量是評估該測序技術先進與否的三個重要指標.第一代和第二代測序技術除了通量和本錢上的差異之外,其測序核心原理除Solid是邊連接邊測序之外都是基于邊合成邊測序的思想.第 二代測序技術的優點是本錢較之一代大大下降,通量大大提升,但缺點是所引 入PCR過程會在一定程度上增加測序的錯誤率,并且具有系統偏向性,同時讀長也比較短.第三代測序技術是為了解決第二代所存在的缺點而開發的,它的根本特點是單分

37、子測序,不需要任何PCR的過程,這是為了能有效防止因PCR偏向性而導 致的系統錯誤,同時提升讀長,并要保持二代技術 的高通量,低本錢的優點.表1:測序技術的比擬第X代公司平臺名稱測序方 法檢測 方法大約讀長堿基數優點相對局限性第一代ABI/生命技術公司3130xL-3730xL桑格- 毛細管 電泳測/光學600-1000高讀長,準確度 一次性達標率 高,能很好處理通量低；樣品制備本錢高, 使之難以做大量的平行測序序法重復序列和多聚 序列第一代貝克曼GeXP遺傳分析系統桑格- 毛細管 電泳測 序法/光學600-1000高讀長,準確度 一次性達標率 高,能很好處理 重復序列和多聚 序列；易小型化通

38、量低；單個樣品的制備成 本相對較局第一代Roche/454基因組測序儀FLX系統焦磷酸測序法光學230-400在第二代中最高 讀長；比第一代 的測序通量大樣品制備較難；難于處理重 復和何種堿基多聚區域；試 劑沖洗帶來錯誤累積；儀器 昂貴第一代IlluminaHiSeq2000,HiSeq2500/MiSeq可逆鏈 終止物 和合成 測序法/光學2x150很高測序通量儀器昂貴；用于數據刪節和 分析的費用很高第一代ABI/Solid5500xlSolid 系統連接測 序法/ 光學25-35很高測序通量； 在廣為接受的幾 種第二代平臺 中,所要拼接出 人類基因組的試 劑本錢最低測序運行時間長；讀長短,

39、 造成本錢高,數據分析困難 和基因組拼接困難；儀器昂 貴第一代搠利克斯Heliscope單分子 合成測 序法/光學25-30高通量；在第二 代中單分子 性質的測序技術讀長短,推高了測序本錢, 降低了基因組拼接的質量； 儀器非常昂貴第 三 代太平洋生物 科學公司PacBio RS實時單 分子DNA 測序/光學1000高平均讀長,比 第一代的測序時 間降低；不需要 擴增；最長單個 讀長接近3000 堿基并不能高效地將DNA聚合 酶加到測序陣列中；準確性 一次性達標的時機低81-83% ; DNA聚合酶在 陣列中降解；總體上每個堿 基測序本錢高儀器昂貴；第 三 代全基因組學 公司GeXP遺傳分析系統

40、復合探 針錨雜 交和連 接技術/光學10在第三代中通量 最高；在所有測 序技術中,用于 拼L個人基因 組的試劑本錢最 低；每個測序步 驟獨立,使錯誤 的累積變得最低低讀長；模板制備阻礙長 重復序列區域測序；樣品制 備費事；尚無商業化供給的 儀器第 三 代on Torrent/生命技人公 司個人基因組測序儀PGM合成 測序法以離感場 效應 晶體 管檢 測pH100-200對核酸堿基的摻 入可直接測定； 在自然條件下進 行DNA合成不 需要使用修飾過 的堿基一步步的洗脫過程可導致錯 誤累積；閱讀高重復和同種 多聚序列時有潛在困難；值變 化第三代牛津納米孔 公司gridION納米孔 外切酶 測序電流問未止里有潛力到達高讀 長；可以本錢生 產納米孔；無需 熒光標記或光學 手段切斷的核甘酸可能被讀錯方 向；難于生產出帶多重平行 孔的裝置表2:主流測序機器的本錢測序比擬hiPlJTChrtS?CMlAddihc*n-fllinMnimeinKJ1、TViE mn<rnrtbln?nrc«cRie size CGBdPriirmry |1|rnrfErrnr%(%fDpsktnpr tinSuhshhitinnIE |r T nniiim便Slfif 12 h45 (dpskmpl<3<14FfIikirl11舊 FLX Titan