1、微柱凝膠檢測技術在輸血前微柱凝膠檢測技術在輸血前相容性試驗中的應用相容性試驗中的應用主要內容一、血凝試驗技術發展二、在血型檢測中的應用三、在抗體篩查中的應用四、在交叉配血中的應用一、血凝試驗技術發展一、血凝試驗技術發展o血凝實驗：是指抗體和紅細胞在液體介質中發生的肉眼可見的凝集反應。根據介質的不同可以分為下列5種n鹽水法n凝聚胺法n酶介質凝集試驗n試管抗人球蛋白法nMGIA- Coombs試驗（微柱凝膠） 鹽水介質法l是最早最簡單的方法。是最早最簡單的方法。l懸浮于鹽水介質中的紅細胞與相應抗體分子懸浮于鹽水介質中的紅細胞與相應抗體分子結合，交叉聯結形成肉眼可見的凝集。結合，交叉聯結形成肉眼可見

2、的凝集。l主要檢測主要檢測IgM類抗體（類抗體（ABO系統、抗系統、抗E）。）。鹽水介質法鹽水介質法結果分析：先觀察有無溶血、再觀察有無凝。n要求：細胞濃度25%、血清與細胞比例、反應溫度、弱凝集分析優點：簡便、快捷、直觀、成本低。缺點：n不能發現不完全抗體n人為因素影響大聚凝胺試驗原理：MPT法是利用陰離子溶液和聚凝胺減少 紅細胞表面的陽離子層及Zeta電位，促 進IgG與紅細胞的結合，縮短紅細胞之間 的距離而使紅細胞凝集。聚凝胺試驗+ + +聚凝胺聚凝胺+無凝集無凝集+有凝集反應有凝集反應- - - - - 枸櫞酸納枸櫞酸納- - - - -聚凝胺試驗o優點n簡便快捷，可用于某些不完全抗體

3、檢測。o缺點n它受冷凝集、肝素等因素的影響較大n靈敏度低，對抗-K漏檢n人為影響因素大o振搖的力度和解聚的時間需要嚴格掌握，要求輕輕轉動試管并同時觀察結果，觀察時間不應超過1 min，弱凝集用力振搖或放置時間稍長便可能消失。o試驗結果需在顯微鏡下觀察，故對操作者的技術要求較高，也增加了結果判斷的不確定性。 聚凝胺試驗o凝聚胺技術在交叉配血中具有快速檢出凝聚胺技術在交叉配血中具有快速檢出 IgG 抗體能力，抗體能力，但近年來隨著對臨床無效輸血的深入研究發現，凝聚胺但近年來隨著對臨床無效輸血的深入研究發現，凝聚胺試劑對弱的、效價低的試劑對弱的、效價低的 Rh 血型系統的抗體有漏檢的血型系統的抗體有

4、漏檢的情況，且不同廠家、不同批號的凝聚胺試劑在抗體的檢情況，且不同廠家、不同批號的凝聚胺試劑在抗體的檢出率均存在一定的差異。出率均存在一定的差異。酶介質凝集試驗o原理：紅細胞表面有豐富的唾液酸，帶有負電荷，使紅細胞相互排斥。蛋白水解酶能消化破壞這種唾液酸，減少紅細胞表面的負電荷以及紅細胞之間的排斥力，縮短了紅細胞之間的距離，使IgG分子能與有相應抗原的紅細胞產生凝集。o常用的酶：菠蘿酶、木瓜酶、胰酶、無花果酶。酶介質凝集試驗o優點n可以增強一些抗原抗體系統的反應活性 Rh和Kidd系統最明顯。o缺點n會破壞一些抗原的結構(M、N、Fya、Fyb)n酶液批次不同，孵育時間均不同n操作復雜n少數人

5、對酶液過敏Coombs試驗o人紅細胞表面抗原與不完全抗體結合（常是IgG類抗體），不完全抗體致敏紅細胞，由于該不完全抗體分子質量小，而且兩個Fab段擴張角度小，不能使相鄰紅細胞橋聯，紅細胞仍處于分散狀態，不出現肉眼可見的紅細胞凝集現象。在反應體系中，加入針對該抗體的抗體，即抗-抗體，該抗-抗體Fab段結合相鄰紅細胞上不完全抗體Fc段，出現肉眼可見的紅細胞凝集現象，該抗-抗體即稱之為抗人球蛋白抗體。Coombs試驗 直接直接Coombs試驗試驗 用于檢測已粘附在紅細胞表面的不完全抗體。即將受檢紅細胞充分洗滌后，將抗球蛋白試劑加入已結合有抗體的受檢紅細胞懸液中，即可見細胞凝集。Coombs試驗試驗

6、 間接間接Coombs試驗試驗 用于檢測游離在血清中的不完全抗體。即將待測血清標本加入具有特異抗原的紅細胞懸液中，如果抗原抗體相應則發生結合，再加入抗球蛋白抗體，則出現紅細胞凝集Coombs試驗oCoombs試驗是理論上最明確、最準確的方法，是國際公認的金標準。但是由于其繁瑣的操作，又不能同時對多份標本檢測，只能將該試驗用在少數標本的確定中，很難臨床常規開展。微柱凝膠檢測技術1990年，法國人年，法國人Y. Lapierre發表文章介紹了一項免疫學檢測新發表文章介紹了一項免疫學檢測新技術：將抗原抗體反應與凝膠分子篩技術相結合，即微柱凝膠免疫技術：將抗原抗體反應與凝膠分子篩技術相結合，即微柱凝膠

7、免疫實驗。該技術的本質是血凝試驗，即紅細胞抗原抗體在微柱腔內的實驗。該技術的本質是血凝試驗，即紅細胞抗原抗體在微柱腔內的凝膠介質中發生肉眼可見的免疫凝集反應。凝膠介質中發生肉眼可見的免疫凝集反應。 原理n微柱凝膠免疫反應的本質是紅細胞凝集試驗，也可稱之微柱凝膠血凝試驗微柱凝膠免疫反應的本質是紅細胞凝集試驗，也可稱之微柱凝膠血凝試驗（Microcolumn Gel Heamagglutination Assay，MGHA），）， 在在微柱凝膠管中，紅細胞和相應抗體結合后，形成紅細胞凝集團塊。在一定離微柱凝膠管中，紅細胞和相應抗體結合后，形成紅細胞凝集團塊。在一定離心力下，該凝集團塊位于膠表面或膠

8、中；而紅細胞未和相應抗體結合，仍為心力下，該凝集團塊位于膠表面或膠中；而紅細胞未和相應抗體結合，仍為分散的紅細胞，在同樣的離心力下，紅細胞沉降到微柱管尖底部。分散的紅細胞，在同樣的離心力下，紅細胞沉降到微柱管尖底部。廣闊應用紅細胞抗原抗體檢測紅細胞抗原抗體檢測多種病原微生物檢測多種病原微生物檢測腫瘤標志物檢測腫瘤標志物檢測神經內分泌因子檢測神經內分泌因子檢測血小板抗原抗體檢測血小板抗原抗體檢測MGIAMGIA應用ABO血型檢測；Rh血型抗原檢測；不規則抗體篩檢；交叉配血；HDN檢測；血小板抗體篩檢；血小板交叉配血。特點及優點1.簡單，不需洗滌，對陰性結果不需確證試驗，解決了 Coombs試驗因

9、為程序復雜費時等原因未能在臨床常規應用問題。2.使不完全抗體檢測理論“金標準”成為臨床的“金標準”。3.多份標本一次離心出結果，有利于臨床大量標本檢測。4.另外還具備準確、敏感、標本用量少、結果保存時間長、易于標準化、操作更安全等優點。特點及優點結果清晰、易于判讀，準確度、敏感性高，標準化加樣、規范化操作，排除了傳統方法人為因素的干擾。不足較傳統方法成本稍高；抗體篩查、配血須經孵育過程，耗時較傳統方法稍長，不適用于緊急輸血。二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用ABO、RhD血型定型檢測 進行ABO正反定型試驗、D抗原檢測，包括了臨床血型的常規檢測項目，并設有質控孔。 操作簡單，結果清晰

10、、 準確，尤其對弱抗原和 亞型的檢有傳統的方法 無法比擬的敏感性，成 為臨床血型檢測的常規 方法。 二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用Rh血型抗原檢測 進行D、C、c、E、e五種主要抗原檢測，達到最大相容性輸血。二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用注意事項： 要求標準化加樣、規范化操作，可排出了傳統方法中人 為因素的影響； 按要求準備標本，防止溶血、纖維蛋白等影響結果； 按要求準備試劑卡，防止由于試劑卡問題影響結果。 二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用常見問題分析及處理： 陰性對照孔假陽性： 首先觀察標本，是否有溶血、細胞黏連等情況；了解臨床信息，是否可能有自身凝集

11、、冷凝集等情況；試劑卡是否平衡； 樣本細胞進行洗滌、必要時可以進行溫鹽水洗滌，重新準備試劑卡，按標準操作流程重復試驗。 二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用陽性結果反應較弱： 由于老年、新生兒、腫瘤、白血病等導致抗原抗體反應減弱。 首先判斷正反定型是否相符，如相符只是反應較弱、不影響出結果； 也可以采取一些增強反應：正定型反應較弱：可采取增加細胞濃度、室溫孵育等方法；反定型反應較弱：可采取增加血漿量、4孵育等方法。二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用混合凝集： 首先要判斷是否為真正意義上的混合凝集： 如凝膠表面出現類似一條紅線、并非真

12、正陽性；多數由于纖維蛋白、細胞破碎等引起；洗滌細胞、重新處理血漿可以解決。 如凝膠中有散在分布，判斷為弱陽性反應。 如為標準的混合凝集，首先排除操作問題，如取血漿時 帶有自身細胞，可能引起反定型出現混合凝集；另外就是樣本問題，如：近期輸血、妊娠，造血干細胞移植、白血病、亞型等。二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用 正反定型不符： 建議采用“三步法”進行分析、確證。第一步：復查ABO血型，排除人為因素、操作失 誤。重新采集血樣、核對試劑和器材。第二步：將需定型病人歸納進五大類33種原因分 類表，“對號入座”，逐一排除，剩下幾條 不能排除者第三步

13、：針對剩下的幾種不能排除的因素，設計 針對性實驗來驗證。二、在血型檢測中的應用二、在血型檢測中的應用在血型檢測時出現問題，較簡單的常規處理主要有：洗滌細胞重復試驗，O細胞、自身細胞做反定，增加細胞濃度、血漿量，4、室溫孵育后再離心等。三、在不規則抗體篩查中的應用三、在不規則抗體篩查中的應用不規則抗體是指不符合ABO 血型系L andsteiner 法則的血型抗體, 也就是抗-A、抗-B 以外的血型抗體, 其中多為IgG 抗體。不規則抗體主要是經輸血或妊娠等免疫刺激產生, 在鹽水介質中不能凝集而只能致敏相應抗原的紅細胞, 必須通過特殊介質(如酶、抗人球蛋白、凝聚胺等) 才能使致敏紅細胞出現凝集反

14、應。目前, 臨床上報道的交叉配血不合大多數是由于患者血液中不規則抗體的存在而引起的。國內報道的溶血性輸血反應共126例, 其中檢測出不規則抗體121例, 占溶血性輸血反應原因的96%。輸血前不規則抗體篩查可以避免因輸血引起的溶血反應, 確保臨床輸血安全。三、在不規則抗體篩查中的應用三、在不規則抗體篩查中的應用臨床輸血技術規范規定：交叉配血不合；有輸血史、妊娠史或短期內需要接收多次輸血者；需要進行抗體篩選試驗。主要是在配血前，利用標準篩檢細胞檢測患者血漿中的抗體。檢測細胞的要求 不能將多人份紅細胞混合，一定要用2-3人份的試劑紅細胞，以避免紅細胞混合后，對弱抗原紅細胞的稀釋。 美國FDA對注冊和

15、批準作為商品供應的用作不規則抗體篩檢的試劑紅細胞的要求為必須表達：D、C、E、c、e、M、N、S、s，Pl、Lea、Leb、K、k、Fya、Fyb，JKa、JKb。三、在不規則抗體篩查中的應用三、在不規則抗體篩查中的應用通過實踐發現,對申請輸血患者進行常規抗體篩選后,篩選結果陰性者交叉配血能在很短間內完成,很少出現不合現象,大大提高了配血成功率;對陽性者則進行進一步抗體鑒定,提前準備相合血液,以保證體內有不規則抗體的患者及時用血,避免由血型不合引起的輸血反應,收到了滿意效果。另外，部分血型系統的抗原、抗體具有劑量效應（如Rh）,在交叉配血中可能出現漏檢的情況（如雜合子可能不出現陽性反應）,在抗

16、體篩查試驗中由于使用標準篩檢細胞，排除了劑量效應的影響。三、在不規則抗體篩查中的應用三、在不規則抗體篩查中的應用不規則抗體篩檢微柱凝膠檢測技術沿用抗人球蛋白的原理，將傳統抗人球蛋白試驗轉移到凝膠卡中，對患者血漿抗體進行篩查，解決了傳統方法因操作復雜費時的問題，應用于臨床常規檢測。三、在不規則抗體篩查中的應用三、在不規則抗體篩查中的應用注意事項：按要求準備標本，上清澄清；標準化加樣，先加篩檢細胞，后加血漿；注意加樣后需要37孵育15min，再離心。三、在不規則抗體篩查中的應用三、在不規則抗體篩查中的應用常見問題分析、處理：假陽性： 如凝膠表面出現紅線、尖底部細胞呈陰性、呈疑似混合凝集，多為纖維蛋

17、白影響或標準篩檢細胞有溶血破碎情況；洗滌細胞、重新處理血漿可以解決。 如凝膠中有很少細胞散在分布，需重復試驗加以確認；在冬天氣溫較低時可能引起細胞活性降低、造成假陽性（拖尾）；可以考慮適當延長孵育時間（一般延長5min）。四、在交叉配血中的應用四、在交叉配血中的應用 檢測受血者血清中抗體和獻血者紅細胞抗原為主側交叉配血試驗，以及檢測受血者紅細胞和獻血者血清中抗體為次側交叉配血試驗相容性，對其中是不完全抗體的，只能應用間接抗人球蛋白試驗確定其相容性。 ABO血型抗體是完全抗體，但更多的臨床有意義抗體是不完全抗 體，如Rh、Kidd、Duffy等血型抗體。如有輸血史、妊娠史（包括流產史）、應用過血

18、液制品史等情況的患者輸血前都應該進行檢測不完全抗體的交叉配血試驗。四、在交叉配血中的應用四、在交叉配血中的應用交叉配血 含有抗人球蛋白試劑，可同時檢出IgM 和IgG類抗體，另有加入抗C3d 的品種，使臨床輸血更安全，杜絕輸血反應的發生。 經過孵育，排除 傳統方法冷凝集 的干擾。四、在交叉配血中的應用四、在交叉配血中的應用 通過凝聚胺配血法和微柱凝膠卡配血法的結果比較，100例交叉配血實驗中，凝聚胺法有3例發生凝集反應，其中1例為受血者血液標本纖維蛋白去除不完全，1例為受血者血液標本高冷凝集素，1例為主側不凝集、次測凝集，經抗人球蛋白試驗呈陽性；微柱凝膠法有5例發生凝集反應，其中1例為受血者血

19、液標本纖維蛋白去除不完全，1例為受血者血液標本高冷凝集素，3例為主側不凝集、次測凝集，經抗人球蛋白試驗均呈陽性。四、在交叉配血中的應用四、在交叉配血中的應用注意事項：按要求準備標本，血辮血樣要離心；主、次側加樣成分；加樣順序，先加紅細胞懸液、后加血漿；可以使用低離子液配制紅細胞懸液，增強反應。四、在交叉配血中的應用四、在交叉配血中的應用配血不合配血不合標本準備標本準備血型影響血型影響方法選擇方法選擇免疫性原免疫性原因因非免疫性非免疫性原因原因其他其他 多種因素相互交織標本準備正確的交叉配血結果來源于正確的血液標本n嚴禁從靜脈輸液部位采集標本。因為不僅所用藥物會對配血結果產生影響，而且稀釋的血液

20、標本配血時極易發生前帶或后滯現象。n血標本應代表患者當前的免疫學狀態，必須采用輸血前 3 天內的標本。血型影響在引起配血不合或溶血性輸血反應的原因中 nRh 系統的免疫抗體位居第 1 位（占 50. 75%）n其次是自身抗體（占 41. 79%，主要發生在自身免疫性溶血性貧血病例中）n第 3 位才是 ABO 和 Rh 以外其他系統抗體（僅占7. 46%血型影響 由不規則抗體引起配血不合共由不規則抗體引起配血不合共53例例,占總數占總數581份標本份標本的的8.43%;單一抗體單一抗體48例例,占占90.4%;復合抗體復合抗體5例例,占占9.6%。Rh系統系統35例例,占占66. 04%; MN

21、Ss系統系統15例例,占占28.3%;抗抗A1 2例例,占占3.74%;Diego 1例例,占占1.88%免疫性原因n免疫性原因主要由機體產生不規則抗體或自身抗體所造成的，交叉配血時表現為主側凝集或主次側均可發生凝集。國內報道的交叉配血不合主要由不規則抗體所致，占61.5%，而其中又以抗-E和抗-C多見。免疫性原因 自身抗體引起的交叉配血不合，包括冷凝集和溫型自身抗體導致的非特異性凝集。主要見于自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡所致的自身免疫性溶血性貧血或肝硬化的病人，這種類型引起的交叉配血不合主次側均可凝集。n對于冷凝集現象可以采用自身對照和 37 水浴以及遞增鹽水溫度洗滌患者紅細胞等方法排除

22、非特異性凝集的干擾。n對于溫型自身抗體可以采用吸散和放散試驗后取患者的紅細胞與血清和同型的洗滌紅細胞進行交叉配血。n自身免疫性溶血性貧血、急性溶血時，應盡量避免輸血。非免疫性原因n非免疫性原因是由于血清蛋白紊亂、白球蛋白倒置或者是某些藥物破壞了紅細胞表面的zeta 電位，從而使紅細胞呈串錢狀凝集，交叉配血時主要表現為主側凝集。非免疫性原因 鏡下紅細胞扁平而表面相互依附，呈串錢狀堆集的有21 例，因不是真正的凝集， 紅細胞膜完整。查看患者病例，2例為多發性骨髓瘤患者，5例為肝病患者 （蛋白倒置），14例分別因出血、創傷休克或術后，有補充血容量而輸右旋糖肝史。n血清蛋白紊亂及白球蛋白比例倒置引起的

23、假凝集。多發性骨髓瘤患者、肺癌患者、肝癌患者、鉤蟲病。n藥物引起的交叉配血不合。因出血、創傷休克或術后，有補充血容量而輸右旋糖肝史、應用VitC和 KCl 也可引起。其他oTF抗原（T多凝集紅細胞）n正常情況下，人紅細胞TF抗原為隱蔽抗原，不暴露，但是在細菌感染時，細菌分泌的神經氨酸酶可使紅細胞膜TF抗原暴露。正常人血清中均含有抗-TF抗體（自然發生的抗體），與TF抗原暴露的紅細胞均發生血凝反應，稱之T多凝集現象。此外一些腫瘤、白血病患者的紅細胞也發生TF抗原暴露。n對于腸套疊、腸梗阻、敗血癥和菌血癥患者的紅細胞血型檢測，應用單克隆抗體-A/-B血型試劑，其中不含有-T，才能正確判斷血型。n在

24、細菌感染患者，特別是腸套疊、腸梗阻患者以及對腫瘤、白血病患者輸血前交叉配血時，一定要高度重視次側管，避免漏檢TF暴露的紅細胞。具體原因分析及處理主側不合： 患者血漿原因： 有針對供者紅細胞的抗體(抗體鑒定) 有自身抗體(自身抗體配血法，如吸收放散等處理后配血) 有冷凝集素(升溫后配血) 有血漿蛋白紊亂(加鹽水稀釋) 供者紅細胞原因： 直抗陽性(換供者) 全/多凝集(換供者) 其他： 藥物抗體(罕見，用藥史，停藥后配血)具體原因分析及處理次側不合：供血者血漿原因：（換供者） 針對患者紅細胞的抗體 自身抗體 冷凝集素 血漿蛋白紊亂患者紅細胞的原因： 直抗陽性(45度放散后再配血)(常見原因) 全凝集或多凝集 粘附免疫球蛋白(洗滌紅細胞)常規處理方法建議采用“三步法”：第一步，排除人為因素/操作失誤和供者血液不合格 1、人為因素/操作失誤 1) 標本污染, 標本取錯或加錯; 2)試劑 不規范, 試劑污染; 3)操作不規范, 或未嚴格按照試劑說明書操作; 4) 采用AHG試驗時的離心力不標準或過大。 2、供者血液不合格 1 )供者紅細胞直接抗球蛋白試驗; 2)供者紅細胞+ AB 型血清試驗(排除全凝集或多凝集)。常