1、蛋白質(zhì)含量測(cè)定主要有五種方法，分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)法。這五種方法各有特點(diǎn)，優(yōu)缺點(diǎn)明確。凱氏定氮法蛋白質(zhì)是含氮的化合物。 食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化， 使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后， 再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定， 根據(jù)酸的消耗量來(lái)乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。 因?yàn)槭称分谐鞍踪|(zhì)外， 還含有其它含氮物質(zhì)， 所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。優(yōu)點(diǎn)：重現(xiàn)性好，是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法 , 是一種蛋白質(zhì)測(cè)定的經(jīng)典方法, , 測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確。缺點(diǎn)：操作比較繁復(fù)，費(fèi)時(shí), 試劑消耗量大。且此法測(cè)定的

2、蛋白質(zhì)含量實(shí)際上包括了核酸，生物堿，含氮類脂，卟啉，含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物。雙縮脲定氮法雙縮月K ( NHCONHCON混兩個(gè)分子月尿經(jīng)180c左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4 形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。 凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵， 或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵， 這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。 紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為170mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸錢、 Tris緩沖液和某些氨基酸等。優(yōu)點(diǎn)：較快速 ，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，

3、以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。 因此雙縮脲法常用于需要快速， 但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。缺點(diǎn)：不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似。紫外吸收定氮法雙縮脲法是傳統(tǒng)的分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的方法, 當(dāng)含有兩個(gè)或者兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)和堿性的硫酸銅反應(yīng)時(shí), 形成紫色的絡(luò)合物 , 這個(gè)顏色產(chǎn)物是肽鍵中的氮原子和銅離子配價(jià)結(jié)合的結(jié)果。 蛋白質(zhì)分子中， 酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵， 使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。 形成顏色產(chǎn)物的量取決于蛋白質(zhì)的濃度。實(shí)際測(cè)定時(shí), 必須預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液制作一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)校正曲線 , 通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液加入

4、雙縮脲試劑后 , 反應(yīng)生成的顏色產(chǎn)物用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度, 以雙縮脲試劑加緩沖或水作空白對(duì)照。然后將測(cè)得的值分別對(duì)蛋白濃度(mg/ ml) 作圖 , 得標(biāo)準(zhǔn)曲線。 未知蛋白樣品用雙縮脲試劑做同樣處理根據(jù)測(cè)得吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查得未知蛋白質(zhì)樣品中得蛋白質(zhì)濃度。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)各種蛋白質(zhì)呈色基本相同 ; 特異性和準(zhǔn)確度好, 精密度好 ; 呈色穩(wěn)定性好 , 試劑單一 , 方法簡(jiǎn)便。快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)， 有一定的誤差。 故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)

5、蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。 若樣品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法， 加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因 pH 的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。酚試劑法此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即 Folin酚試劑， 以增加顯色量， 從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。 這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是： ?在堿性條件下，蛋白質(zhì)中

6、的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 ?Folin 酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色(鉬蘭和鎢蘭的混合物) 。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高, 比雙縮脲法靈敏約 100 倍。操作簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)： 費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)， 要精確控制操作時(shí)間， 標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry 反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、 Tris 緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（%） ，硫酸納（1%） ，硝酸納（1%） ，三氯乙酸（%）

7、 ，乙醇（5%） ，乙醚（5%） ，丙酮（%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度12 倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加F olin 酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH 條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生， 故當(dāng) Folin 一酚試劑加到堿性的銅蛋白質(zhì)溶液中時(shí)， 必須立即混勻，以便在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰 的位置（？maX ,由465nm

8、變?yōu)?95nm溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研 究認(rèn)為， 染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 （特別是精氨酸） 和芳香族氨基酸 殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值 隈5,與蛋白質(zhì)濃度成正比。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry 法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1?g。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物 有更高的消光系數(shù)， 因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry 法要大的多。 測(cè) 定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5 分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程， 大約只要 2 分鐘即可完成， 其顏色可以在1 小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定， 且在 5 分鐘

9、至 20 分鐘之間， 顏色的穩(wěn)定性最好。 因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry 法的K+、 Na+、 Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、琉基乙醇、EDTA?均不干擾此測(cè)定法。缺點(diǎn)：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford 法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 ? 球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)， 以減少這方面的偏差。 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定,主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS和的 NaOH。 （如同的酸干擾Lowary 法一樣。 ）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用 Beer 定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。應(yīng)用范圍凱氏定氮法適用樣品廣泛是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一法 。適合于各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定以及各類動(dòng)植物蛋白測(cè)定。適用于 氮，誤差為