1、從液相合成催產素到天然化學連接法多肽合成學簡史杜興 華易 馬成 王詩達學術之道第九組（ 清華大學 北京 100084 ）摘要 化學合成多肽作為生物化學界的一項重要內容，在一個世紀前迪維尼奧教授用液相合成技術合成催產素時就已經悄然起步。由于在多方面展現出的優越性，體外人工合成多肽一直被生物化學界予以極高關注，它也從最初的液相合成一步步發展出固態合成、天然化學連接法等各種新興分支，并取得了很多成就，甚至合成出了一些具有復雜結構的蛋白質。本文欲從整體綜述人工合成多肽百年的科學歷程，并對這其中的部分發展革新具體分析，梳理出一條人工合成多肽的學術之路。關鍵詞 多肽合成，基因工程，中國人工合成胰島素0 引

2、言美國著名科學家、諾貝爾獎獲得者朱棣文教授曾預言“21世紀的生物工程就是研究基因工程與蛋白質工程”1，而多肽化學全合成技術作為蛋白質工程中的一項尖端技術，長年以來一直被生物化學界投以極高關注。隨著多肽化學全合成技術的日益進步，其成果也從最初的催產素、牛胰島素等簡單結構短鏈多肽發展進步到了一些結構功能多樣化的蛋白質如HIV-1蛋白酶、人造紅血球生成蛋白（SEP）等。而先前成果在臨床醫學、藥物學等領域所做出的巨大貢獻讓科學家們對追求效率更高、產物復雜程度更高的新合成方法一直都有著高昂的熱情。下面我們將從一個世紀前迪維尼奧的液相合成催產素講起，完整的敘述人工合成多肽百年春秋的學術之道。1 多肽化學全

3、合成的開端迪維尼奧與催產素1.1 迪維尼奧生平 前面已經多次提到迪維尼奧這位蛋白質化學全合成界的泰斗，那么下面我們先來簡單的了解一下這位學術“大牛”的生平和學術貢獻：文森特·迪維尼奧（Vincent du Vigneaud），1901年5月18日，迪維尼奧出生在美國伊利諾伊州芝加哥市，他的父親是一名晚期的發明家和機械設計師。迪維尼奧在大學時期師從馬維爾（C.S. Marvel）教授，并在1923年取得伊利諾伊大學學士學位，在1924年取得碩士學位。從伊利諾伊大學畢業后，他先后在費城總醫院、賓夕法尼亞大學醫學研究生院等地繼續深造，并在1927年向羅切斯特大學醫學院提交了他的博士論文。迪

4、維尼奧回到美國后，在1932年成為喬治華盛頓大學醫學院的生化科主任；從1938年開始他擔任康奈爾大學醫學院的生物化學系主任教授。迪維尼奧也曾在美國和英國的許多大學開設講座，比如在英國的劍橋的Liversidge講座。迪維尼奧的研究主要集中在含硫化合物在生物化學的重要性，期間他一直致力于催產素的研究，他將催產素分解為片段，對這些片段進行研究。他推斷催產素是一種僅由八個氨基酸構成的蛋白質分子2。他也因為對生化方面含硫化合物的研究，尤其是首先用人工方法合成多肽類激素催產素和增血壓素而被授予1955年的諾貝爾化學獎。在迪維尼奧合成催產素之前，天然的催產素數量少且價格昂貴，無法大量使用。當迪維尼奧首先發

5、明人工合成催產素后，催產素開始被大量生產并應用于臨床2。1.2 液相合成法了解過迪維尼奧的生平與貢獻后，下面我們就以催產素為例簡單介紹迪維尼奧所采用的液相合成法的基本原理。催產素（oxytocin）是一種由八個氨基酸連接而成的多肽，這八個氨基酸分別為胱氨酸（cysteine）、酪氨酸（tyrosine）、異亮氨酸（isoleucine）、亮氨酸（leucine）、谷氨酸（glutamic acid）、天冬氨酸（aspartic acid）、甘氨酸（glycine）和脯氨酸（proline）。同時在天冬氨酸、谷氨酸和甘氨酸裸露的羧基上還要修飾上總共3個分子的氨基，這意味著還需要三分子氨氣參與反應

6、。迪維尼奧在學術生涯早期曾經發現提取出來的催產素在經過還原和氧化之后仍然保持了原有的活性，其中的步驟為先用鈉和液氨將催產素還原，此時胱氨酸上的S-S鍵斷開，再進行苯酰化得到S，S-二苯酰衍生物，然后再用鈉和液氨除去苯酰基，接著通入空氣氧化再次得到活力不減的催產素。根據這個現象，迪維尼奧提出了先合成上述的S，S-二苯酰衍生物的思路，為合成催產素打開了大門（具體過程詳見圖1）。1.3 評價經過該反應得到的產物活性和天然產物差距很小，在當時這個合成路線是非常成功的。不過在這個合成過程中利用的反應都是簡單的有機反應，而且我們可以看到迪維尼奧的成功更多的是催產素結構本身S-S鍵的特點導致的，他在合成其它

7、幾種多肽時也多次利用了目標物質一些結構的特點，而缺乏一個模式化的合成方法。雖然迪維尼奧并沒有將氨基酸按順序線性組合，但是可以預測如果仍利用該思路合成氨基酸數量更大的多肽，所需要的反應數量將隨之驟增。再考慮到該反應的技術和普通的有機合成并沒有本質差別，全部在液相中完成。雖然合成催產素中沒有涉及過多分離提純的步驟，但是可以想象，如果要合成更長的肽鏈，在液相中反應后所要求的分離提純過程將花費大量時間。因此該方法僅適用于合成很短的多肽類物質，如果想合成更長的肽鏈，就需要更加高效的合成思路。即便如此液相合成法在當時也有很多應用，在迪維尼奧首次合成了具有生理活性的催產素后，科學家們又分別合成了徐緩激肽、促

8、黑激素、促黑激素、促腎上腺素皮質激素等多種，并都陸續投入了工業生產3。除此之外，百余種其他的多肽類激素也都利用液相合成法進行了合成。圖 1（圖片引用來源：The Synthesis of Oxytocin1 作者：Vincent du Vigneaud, Charlotte Ressler, John M. Swan, Carleton W. Roberts, Panayotis G. Katsoyannis 刊名：Journal of the American Chemical Society, 1954, Vol.76 (12), pp.3115-3121）2 中國科學家的一次重要勝利牛胰

9、島素的合成說到多肽的液相合成法，就不得不提中國科學家團隊在1965年成功人工合成牛胰島素的故事。這一研究項目開始于1958年，由中國科學院生物化學研究所、中國科學院有機化學所和北京大學化學系共同合作開展。這一課題的提出是受到了當時大躍進思想的影響，認為集中兵力解決合成蛋白質的重大課題是多快好省發展科學的最好途徑。而選擇胰島素的原因是它是當時唯一一個已經測出一級結構的蛋白質，人們對其氨基酸序列已經非常確定，這項工作由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在1953年完成，并因此獲得了1958年的諾貝爾化學獎4。在中國團隊開始正式合成胰島素之前，已經有幾個國外的科研小組進行

10、了嘗試，但是產物活性非常低，只有0.5%-1.0%。由于胰島素是一個分為A、B兩條鏈的蛋白質，且氨基酸數量相對于當時僅有的液相合成法而言相對較多，因此整體合成過程十分冗長復雜（我們在這里就不詳細描述了）。不過還是要簡單介紹中國團隊采用的三個創新的技術：1、多次應用一種叫疊氮化物法的合成方法，可保護自由肽的順利縮合；2、在使用鈉-液氨法中最后脫去保護基團時使用了很溫和的反應條件，保護了產物的完整性；3、找到了更好的提純產物沉淀的方法。這三個技術保證了合成的順利進行，而且使最后產物的活性大幅度提高，可以說是非常成功的。然而我們也應該看到，中國科研團隊使用的整體思路與液相合成法別無二致，并沒有對液相

11、合成法本身進行什么改進，而是只針對胰島素提出了一些優化方法。因此這個工作雖然非常艱巨而且其成果是開創性的，但是它并沒有獲得諾貝爾獎。不過我們也必須看到中國科研團隊在當時極其艱難的科研環境下使用簡單的合成法所做出的不簡單的成果，這樣的精神是我們在學術之道上必不可少的。下面我們將再次回到人工合成蛋白質的發展歷史中，來了解一下固相合成方法的誕生歷程。3 “新標準”固相合成法3.1 梅里菲爾德發明固相合成法隨著迪維尼奧發明了液相合成多肽法，說明了多肽的化學合成完全可以實現。但是，在當時利用液相合成多肽法既繁瑣又產率低下，因此多肽合成是一項非常困難的工作。一種肽的合成往往花費幾年時間，且失敗率極高，于是

12、在1959年，新型固相合成法就順勢誕生了。在談到固相合成的具體原理之前，我們也先來了解一下1984年諾貝爾化學獎得主、多肽固相合成法的發明者羅伯特·布魯斯·梅里菲爾德（Robert Bruce Merrifield）5的生平和他創造固相合成的過程。1921年7月15日，梅里菲爾德出生在德克薩斯州沃斯堡。他是家中唯一的兒子6。他的大學開始于帕薩迪納專科學校，并在兩年后轉入美國加州大學洛杉磯分校（UCLA）。在化學研究中，他在菲利普河公園的研究基金會工作了一年，之后回到了生物化學碩士教授Dunn開發的嘧啶類化合物的定量微生物方法UCLA化學系研究生院。婚后他開始在洛克菲勒學院（

13、后來的洛克菲勒大學）為對他的職業生涯影響深遠的D.W. Woolley博士做助手。他們對梅里菲爾德在大學期間發現的二核苷酸生長因子和Woolley早期發現的多肽生長因子促長肽進行研究。這些研究使他們發現肽合成的需要，他認為需要一種“快速、定量和自動合成蛋白質的方法”。梅里菲爾德當時認為可以將化學合成中新生成肽的羧基與一種固體聚合物相連，這將大大減少羧基的反復保護程序和簡化中間肽的分離。不久，梅里菲爾德從一份1957年英國的專利中得到靈感，最終將羧基與聚苯乙烯樹脂(后來改進出多種聚合物)相連。梅里菲爾德還需要開發出更理想的氨基保護基團，他改進傳統方法選擇了叔丁氧羰基(benzyloxycarbo

14、nyl，BOC), 因此該方法又被稱為BOC法。1962年春天，梅里菲爾德終于使用這種新方法合成一個四肽Leu-Ala-Gly-Val，他將該方法稱為SPPS，該結果首先在美國實驗生物學聯合會舉辦的會議上報道，隨后全文于1963年在美國化學協會雜志上發表，成為該雜志的經典論文之一6。 3.2 固相合成法原理固相合成法的基本原理是首先準備好帶有末端保護基團的氨基酸，再將目的肽的第一個氨基酸的羧基用共價鍵與固相載體（樹脂）連接，以這個氨基酸的氨基為起點，與其相鄰的氨基酸的羧基進行縮合反應，形成第一個肽鍵。接下來再將下一個氨基酸與上述得到的樹脂肽反應，重復這一步驟，將需要的氨基酸一個個加上去，直到得

15、到目標肽。最后將目標肽從樹脂上裂解脫落，氧化折疊，分離純化，化學修飾，進行活性鑒定。由于在合成時氨基酸末端需要保護基團，根據保護基團的不同，固相多肽合成法又分為多種方法，例如9-芴甲基羰基法（Fmoc）、叔丁基羰基法（t-BOC）、芐氧羰基法（CBz）和對甲苯磺酰基法（Tosyl）法等。可以看到當時迪維尼奧在合成催產素時就使用了其中的芐氧羰基和對甲苯磺酰基作為保護基團，而梅里菲爾德在進行一些工作時使用了叔丁基羰基法。這些保護基團各有優缺點，目前均有使用。固相合成法在出現之后就成為了多肽合成界的標準方法，而且其經過不斷的改進，達到了從手工操作到儀器自動進行的程度，于是科學家利用Fmoc法和t-B

16、OC法又合成了多種多肽和蛋白質。其中就包括具有很高藥用開發價值和潛力的芋螺毒素7，用碳、氮的同位素標記的具有神經調節功能的神經降壓素（neurotensin）8，RBD(Ras-binding domain)的兩個片段，海洋環肽kahalalide A及其類似物1等多種蛋白質結構域，一種分泌磷酸酶（sPLA2）的片段9，能使絲氨酸和蘇氨酸等殘基脫水的非免疫原性多肽等小分子量酶10。3.3 評價雖然已經收獲頗豐，但固相合成法依然存在著明顯的局限性，最主要的就是可合成的肽鏈長度仍不能過長。而且一旦肽鏈過長，每一次的縮合反應速率都會有不同程度的降低，這對于化學方法本身存在著反應速率低下的情況來說更是

17、雪上加霜。同時，每一次連接之后的分離提純的難度會逐步增加，因為非目的肽的含量會隨反應次數的增多而逐漸增加，這也明顯影響了該方法在合成更長肽鏈時的效率。因此該方法適合合成50個氨基酸以下的短肽類物質，當需要更長的肽鏈時，使用基因工程生產蛋白質成為了更好的選擇。4 橫空出世的基因工程在科學家們對改進固相合成方法一籌莫展之時，在上世紀70年代，基因工程橫空出世了。它的出現無疑給蛋白質的大規模工業生產提供了一個效率極高的方法。Wemer Arber、 Danien Nathans、 Hamilton OSmith三人在基因工程的發展中做出了重要的貢獻，他們發現了限制性核酸內切酶的作用，并因為該項工作共

18、享了1978年的諾貝爾生理學或醫學獎11。基因工程的基本原理在高中課本中均有描述，在這里我們就不進行展開介紹。基因工程相比于化學多肽合成法有著不可比擬的優勢：效率極高。在固相多肽合成法中每一步的反應都可能需要數小時的時間，在這一過程中可以讓大量大腸桿菌生產出比化學方法最終的產量要多得多的產品。然而效率極高的基因工程在當時也存在著一定的問題。首先是大腸桿菌等原核工程菌沒有內質網和高爾基體，無法對一些蛋白質進行進一步修飾，從而得不到目標蛋白質；而且即使使用了酵母菌等真核生物作為工程菌，對蛋白質的某些定向修飾仍然非常困難。同時，當工程菌生產出大量目標蛋白質之后的分離提純過程也是非常復雜的，這是由于生

19、物體內本身存在大量其它非目標蛋白質導致的。顯然化學方法是可以一定程度彌補基因工程的上述缺點的，而且化學方法可以在肽鏈中連接上自然中不存在的氨基酸(現在利用基因工程方法也同樣可以完成12，但在當時還無法做到)，這為人為設計一些蛋白質提供了更多可能。因此化學方法合成蛋白質這一學科并沒有因為基因工程而衰落，而是繼續走上了深入發展的道路，為人類在蛋白質科學的認知道路上做出更多的貢獻。5 天然化學連接法5.1 基本原理多肽固相合成法雖然大大提高了多肽合成的效率，但是其存在的問題仍然制約著其向合成更加復雜多肽的道路的發展。通過分析固相合成法中的一些關鍵步驟，科學家提出了一些優化反應過程的思路。科學家首先提

20、出了先逐步合成多個50個氨基酸左右的多肽鏈再將它們連接的思路，不過這其中的連接過程仍然具有較高的難度。下面簡單介紹一種目前應用較為廣泛的連接方法天然化學連接法（Native Chemical Ligation），或根據其反應的特點也可稱作半胱氨酸肽片段連接法。該方法反應效率較高，在提出后的近20年中進行了各種改進，應用在了很多多肽產品的生產中。該方法的提出者是美國芝加哥大學的Stephen B. H. Kent，他利用了一個在1953年發現的化學反應：硫脂纈氨酸（Val-SPh）和半胱氨酸（CysOH）能在水溶液中快速形成二肽Val-CysOH。Kent在1994年意識到了這個反應在肽片段連接

21、中的應用潛力，并成功基于該反應發展出了天然化學連接法。這一反應要求一個多肽的C端接上了一個硫脂，而另一個多肽的N端是半胱氨酸殘基。（其反應的基本原理如圖2）圖 2該反應顯然存在著一個問題，那就是要求一個多肽的N端必須是半胱氨酸殘基，而半胱氨酸在蛋白質中的含量豐度僅有1.7%，這意味著在運用這種方法合成多肽時我們不能隨意切割多肽片段，極大地限制了多肽化學全合成的靈活度，因此如何擺脫半胱氨酸的限制成為了改進這一方法的主要發展方向。5.2 改進2001年，Dawson等人就發表了將丙氨酸作為N端進行天然化學連接法的研究成果，其基本原理是在使用半胱氨酸連接之后利用催化劑將連接位點的半胱氨酸選擇性氫化去

22、硫，從而實現了丙氨酸與氨基酸的連接。（圖3為該方法機理的簡單示意圖）該方法的意義在于丙氨酸是一種非常常見的氨基酸，人們在利用天然化學連接法合成多肽時就有了更多選擇。2007年，Crich等人發表了用苯丙氨酸作為N端的方法，讓天然化學連接法的多樣性和靈活性更進一 圖 3步。人們也發現了可以直接替代半胱氨酸的方法，如使用甲硫氨酸和組氨酸。除了擺脫半胱氨酸的限制，硫脂一段在溶液中的穩定性不佳也是一個需要改進的重點。之前使用硫脂時一般使用BOC作為保護基團，但是這種方法的反應較劇烈，要求的操作較危險，產率較低，而且會影響產物的一些性質，而Fmoc法可以比較好地改善這些問題，因此人們發展了一些使用Fmo

23、c法的連接方法。有一些方法仍然使用硫脂，為了解決在Fmoc法中硫脂很不穩定的問題，人們使用了一些添加劑來抑制硫脂的解離，或者使用新的合成硫脂的方法來提高硫脂的穩定性。還有些方法則用酰基化合物替代硫脂，并且已經研究出了一系列重要的成果。5.3 應用現代科學家利用上述的天然化學連接法已經可以更加高效地合成HIV-1蛋白酶、人溶菌酶（human lysozyme）等較大的蛋白質產物13，而且還可以合成在醫藥領域具有巨大潛在價值的人造紅血球生成蛋白（SEP）等；與此同時，利用半胱氨酸肽片段連接法，科學家合成出了一種抗微生物的糖蛋白雙翅肽（diptericin）14。此后，又在半胱氨酸肽片段連接方法的基

24、礎上發展出的一種新方法“糖基輔助連接（SAL）”更具普遍性，成為了糖肽及糖蛋白合成上的極有力工具，利用這種方法，科學家再次合成了雙翅肽15以及MUC1糖蛋白16。人們也在多肽連接的反應步驟入手，改善天然化學連接法的效率。最初的反應方法是簡單的順序連接法，為了簡化該方法會帶來的繁瑣的分離純化步驟，Kent等人干脆使用“一鍋法”，即在一步連接反應完成后直接加入下一步所需的底物。這一方法效率較高，不過存在著每一步反應殘余的底物對最后產物的折疊造成干擾的可能性。后來人們發展了收斂法連接，即將目標蛋白質分成好幾個部分，每個部分再繼續分割，在合成時先連接出上述的幾個部分，再將這幾個部分進行進一步連接從而得

25、到目標產物。這一方法中各組反應平行進行，提高了多次連接的效率。人們又發展出了將固相樹脂基底引入多肽鏈連接的反應過程中，形成了固相多肽連接法，不僅減少了每一次反應后分離純化所需要的時間，而且提高了每一次連接反應的效率，使天然化學連接法的實用性大大提升。當然，這些方法仍然存在著多肽鏈不能過長的問題，這仍然是化學方法合成蛋白質中一個重點難題。6 多肽合成學的應用目前多肽化學全合成的應用主要集中在醫療、組織工程等方面。我們從這兩方面入手介紹在人工合成蛋白質的應用。6.1在制藥方面的應用6.1.1合成藥物蛋白質藥物和多肽藥物具有適應癥廣、安全性高且療效顯著的特點，目前這類藥物已經被廣泛地應用于腫瘤、肝炎

26、、糖尿病、艾滋病等疾病的預防、診斷和治療17。我們以一種名為芋螺毒素的海洋肽類為例進行說明。芋螺毒素是一種在熱帶海洋肉食動物芋螺分泌的用于麻醉獵物的肽類。芋螺毒素的種類很多，不同的芋螺毒素作用的目標靶點不同，例如芋螺毒素以肌肉和神經的乙酰膽堿受體為作用靶點18，芋螺毒素以一種鈣離子通道為作用靶點19，同時它們作用的效果也不同。因而為藥物的設計合成提供了廣泛的思路。固相Fmoc法反應條件溫和，副反應少等又是，是合成芋螺毒素的最佳方法，目前利用此法合成的芋螺毒素已有十幾種，它們是治療神經性疾病的候選藥物。一種源于芋螺毒素的名為ziconotide的藥物已經由美國食品及藥物管理局批準上市。這種藥物可

27、以用于慢性疼痛的治療，相比于傳統的嗎啡，它具有療效好、不成癮的優點20,21。目前，已有超過60種此類藥物由美國食品及藥物管理局（FDA）批準上市，并有大約140種處于臨床試驗階段和超過500種處于臨床前研究階段。2011年全球藥品市場上多肽類藥物銷售總額達到141億美元，而到2018年則會達到約254億美元的銷售總額22。可以說藥物和藥物市場的發展速度都十分驚人。可以預見，這種高速發展的狀態將會持續，更多更好的藥物也將被設計、合成出來，造福廣大的患者和制藥企業。6.1.2藥物載體除了可以作為藥物，多肽也可作為藥物載體。例如，科學家設計了一種可以將藥物包住的微球，遇到特定的靶向蛋白酶后微球上的

28、熔斷點會斷開，放出藥物23。利用這種方法，可以把藥物送到指定的身體部位后再釋放藥物，直達患處。具有特異性強，效率高，副作用小等諸多優點。6.2在組織工程方面的應用組織工程，是把工程學和生命科學相結合的交叉學科，其目標是開發能夠修復、維持、改善組織或器官功能的生物替代品。為達到這個目的，一般會將特定的組織、器官細胞種植到一個支架上，在該支架上形成具有生物活性的替代組織、器官24。合適的支架材料的選取和制備就成了主要的研究方向。一些不具有生物活性的聚肽，既與生物細胞有良好的相容性，又不會干擾生物細胞的生命活動，在體內無毒副作用，符合作為支架材料的要求。目前，制備這種聚肽的方法主要有生物合成方法和化

29、學合成方法兩種。但生物合成方法有兩個明顯的缺點：基因序列的不穩定性和表達水平較低，而化學合成方法則克服了這些不足。目前，利用化學合成方法，科學家們已經制備出了可以供纖維細胞、角質上皮細胞、神經元細胞黏附和分化的聚肽25，并有望進一步發展。雖然目前這個領域的研究還處于基礎階段，不過其在器官修復和維持等方面的應用前景卻是不容忽視的。7 結語多肽合成學經歷六十余年的發展，從最初的低效、單一的液相合成已經發展到了現在相對高效率、廣范圍的天然化學連接法，可以說已經取得了長足的進步。但正如我們之前所說，不論是固相合成方法還是天然化學連接法，其機理中內部存在的某些瑕疵仍然制約著其向合成更加復雜蛋白質的道路的

30、發展。因此我們首先展望，在不久的未來，通過技術手段進步與核心機理的革新，我們能夠擴大可合成人工蛋白的范圍，并且大幅度增加合成蛋白的復雜度、進一步縮短合成時間、提高效率、降低合成成本等。同時我們可以通過改良現有方法，嘗試引進稀有氨基酸，構建人為設計的全新蛋白質，并進行新蛋白質的結構與功能的研究。另一方面，如上文所說，多肽合成學在醫學與組織工程中有著不可忽視的前景。我們希望能進一步發揮人工合成產物純度高、制備過程較為簡單等優勢，使藥物或藥物載體的各項性質更優秀，并可以針對藥物的結構進行人為的設計和改動，最大程度發揮多肽化學全合成的功效；同時我們期望將人工合成多肽應用于組織工程中軟骨組織修復26、肝

31、組織工程27和血管組織工程28等重要部分，為科學與醫療事業再做出一份貢獻。參考文獻1 陳心, 羅素蘭, 張本,等. 多肽固相合成的研究進展 J. 生物技術, 2006, 16(1):81-83.2 Encyclopaedia Britannica. Britannica Academic. Vincent du Vigneaud EB/OL. 2016-5-143 楊加華. 多肽和蛋白質的人工合成評述J. 浙江林學院學報,1989, 6(1): 80-88.4 Frederick Sanger. The chemistry of insulin. http:/www.nobelprize.or

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