1、實驗一 小鼠肝組織DNA的提取及鑒定【實驗目的】1、 掌握動物組織DNA提取的方法；2、 掌握紫外分光光度法檢測、鑒定DNA濃度和純度的方法。【實驗原理】獲得相當純度和完整性的基因組DNA，可用于DNA酶切圖譜、多態性分析、基因診斷、構建基因組文庫等。因此，DNA樣品質量的好壞將直接關系到實驗的成敗。較理想的DNA樣品應達到以下三點要求：不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；最大程度地降低蛋白質、多糖和脂類分子的污染；排除RNA分子的污染和干擾。DNA以核蛋白形式存在于細胞中，提取DNA的原則是即要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等成分分離，又要保持DNA分子的完整。本實驗中，用陰

2、離子去垢劑十二烷基磺酸鈉（SDS）消化破裂細胞膜、核膜，并使組織蛋白變性沉淀，DNA從核蛋白中游離分開；為控制組織中脫氧核糖核酸酶（DNase）對DNA的降解，加入檸檬酸鈉或乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）以除去激動該酶的金屬離子，SDS也能使DNase變性失活；蛋白酶K可水解蛋白質，消化DNA酶；分離后的DNA用飽和酚/氯仿抽提除去蛋白質，接著用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用無水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因組DNA。260nm處DNA有最大吸收峰，測DNA的A260，可計算其濃度。而蛋白質在280nm處有最大吸收峰，可測定A260nm/A280nm比值，檢測DNA的純度

3、，該比值介于1.82.0之間。【實驗器材和試劑】1、動物小白鼠2、設備移液器、臺式離心機、水浴箱、陶瓷研缽等；751紫外分光光度計、石英比色皿、洗瓶、濾紙等。3、試劑（1）基因組DNA提取試劑盒（北京康為世紀生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生理鹽水，4貯存（8）無水乙醇、70%乙醇【操作步驟】1、制備肝勻漿迅速處死小白鼠，稱取新鮮肝臟組織50 mg，用預冷生理鹽水洗去血液，濾紙吸干后剪碎組織，將剪碎組織放于組織勻漿器或研缽中研磨，同時加入300 l Buffer CL。將肝勻漿液放入EP管，加入1.5

4、 l蛋白酶K，漩渦震蕩10 s，55孵育直到組織溶解（約1小時）。2、提取DNA（1）加入1.5 l RNase A，顛倒混勻，37孵育15-60 min。（2）冰上孵育1分鐘使樣品迅速冷卻。（3）加入1/3體積的Buffer PP，渦旋震蕩20 s，12000 rpm離心3 min。（4）將上清轉移到個新的離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，可見絮狀沉淀（纖維狀DNA）從溶液中析出。12000 rpm離心1 min，棄上清。（5）加入300 l 70乙醇，顛倒數次以洗滌DNA沉淀。12000 rpm離心1 min，棄上清，室溫干燥15 min。（6）加入50 l Buffer GE溶解

5、DNA（如果DNA的量比較大，可以65孵育以促進DNA的溶解），室溫保存待測。3、DNA濃度和純度的測定取0.1 ml DNA樣品，加蒸餾水至1 ml，在751紫外分光光度計上測A260值和A280值。計算：DNA濃度（g/ml）= A260×50×10 （請問系數50、10是如何得來的？） DNA純度 = A260nm/A280nm【注意事項】（1）由于DNA主要存在于細胞核內，為便于提取DNA，肝臟的破碎要嚴格控制好。即要盡可能的將細胞膜破碎，又要盡可能多保留完整的細胞核，以保留6070的完整細胞核為宜。為避免DNA過度斷裂，不宜用電動研磨器制備勻漿。在提取過程中，染色

6、體會發生機械斷裂，產生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時應盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提，混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。（2）用氯仿除去組織蛋白，要不斷振蕩使蛋白質變性。如要得到高純度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白質。（3）酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應避免接觸皮膚。（4）室溫下干燥時盡可能使殘留的乙醇揮發掉（DNA中殘留的乙醇會影響內切酶的活性或電泳時DNA不下沉），但不要讓DNA完全干燥，否則極難溶解，DNA溶解過程通常需要12-24hr。（5）提取過程應盡量保持低溫。（6）在波長260nm紫外線下，1OD的光密度值相當于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單

7、鏈DNA或RNA為40g/ml；單鏈寡核苷酸為20g/ml。據此來計算核酸樣品的濃度。紫外分光光度法只用于測定濃度>0.25g/ml的核酸溶液。（7）A260nm/A280nm比值應介于1.82.0之間，若比值>2表示DNA樣品中含有較多的RNA，如比值<1.8表明樣品中有蛋白質污染。應根據后續實驗要求，采取不同的方法純化。當然也會出現DNA溶液中既含蛋白質又含RNA，其比值介于1.82.0的情況，所以有必要結合凝膠電泳等方法鑒定有無RNA，或用測定蛋白質的方法檢測是否存在蛋白質。【結果】1、A260 = ，A280 = 。2、小鼠肝組織中DNA濃度是 g/ml。3、小鼠肝組

8、織中DNA的A260nm/A280nm比值是 。【思考題】1、 提取和純化的真核組織DNA有何用途？2、 你的A260nm/A280nm比值結果是否介于1.82.0之間？有何意義？3、 請結合你的實驗結果和操作步驟，分析如何檢測和保證DNA的質量？實驗二 聚合酶鏈反應【實驗目的】 采用聚合酶鏈式反應技術擴增小鼠肝組織平滑肌收縮蛋白（SM22）基因【實驗原理】聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）用于體外擴增位于兩段已知序列之間的DNA區段（靶序列）。其原理是通過耐熱DNA聚合酶催化的DNA合成反應達到對靶序列的擴增。反應中使用兩條化學合成的寡核苷酸作為引物

9、，分別與模板DNA兩條單鏈互補，待擴增序列片段位于兩條引物之問。PCR擴增包括3個步驟，即變性、退火和延伸。反應需要模板、引物、DNA聚合酶和脫氧核糖三磷酸(dNTP)等的參與。反應混合液被加熱以使模板DNA雙鏈變性成為二條單鏈，隨后將反應混合液冷卻至引物的熔點溫度(Tm)以下，使引物能與靶序列形成雜交雙鏈（退火）。當溫度升至72左右時，反應體系中的DNA聚合酶按照模板鏈的序列以堿基互補方式依次把dNTP加至引物的3端，使互補鏈從5 向3方向不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈。通過變性、退火和延伸的一個循環可以使靶序列的分子拷貝數增加一倍。由于每次擴增的產物又作為下一次擴增的模板，因此反應產物的

10、量以指數形式增長，一個分子的模板經過n個循環可得2n個分子拷貝產物。本實驗擴增的是小鼠肝組織平滑肌收縮蛋白（SM22）基因，擴增產物片段大小為541bp。擴增所用的上游引物序列為：5-AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3，下游引物序列為：5-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3。【實驗器材和試劑】1、設備PCR儀、0.2ml PCR反應管、1.5ml離心管、移液器、吸嘴、旋渦混合器。2、試劑（20 l體系）PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技公司）【操作步驟】1、 分別在PCR反應管中加入2× PCR mix 10 l、上游和下游引物

11、各2 l、DNA 2 l和H2O 4 l。2、 把PCR反應管放人PCR儀，按儀器操作要求啟動擴增程序。本實驗的擴增程序為：94預變性5分鐘后進入循環擴增，即94變性30s，58退火30s，72延伸1 min。重復35個循環后，于72再延伸10 min，最后4保溫。3、 反應結束后，將PCR反應管于12000 rpm離心15s，取擴增產物進行電泳分析。【注意事項】1、由于PCR技術的靈敏度高，極微量的污染也會造成擴增的假陽性結果。因此，必須采取相應措施避免發生污染。2、PCR實驗應設立陰性對照反應，即在反應體系中不加模板DNA。3、多份樣品同時擴增時，可配制總的反應混合液，并分裝于PCR管中，

12、然后再在各管中分別加入模板。4、臨床診斷用PCR反應必須在專門的PCR實驗室中進行，實驗室應包括試劑配制室、模板制備室、PCR擴增室和產物檢測室等功能區。PCR實驗中的各個步驟應在相應的功能區中進行。5、PCR試劑與模板DNA及樣品應分別保存于不同功能區的冰箱中。6、操作時應戴手套，配制反應體系和加模板時應分別使用專用的移液器，所有耗材使用前必須經高壓滅菌，用后按規定處理并丟棄在指定容器中。【結果】 【思考題】1、 PCR各組分在反應中的作用是什么？2、 降低退火溫度、延長變性時間會對反應有何影響？實驗三 瓊脂糖凝膠電泳【實驗目的】掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法。【實驗原理】帶電荷的

13、物質在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應用非常廣泛，它已成為分子生物學技術中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優點，已成為分離和鑒定核酸的常用技術。DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA 分子在高于等電點的pH 溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型。具有不同的相對分子質量的DNA 片段泳動速度不一樣，可進行分離。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質量的DNA ，也可以分離相對分子質量相同，及構型不同的DNA 分

14、子。瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。熒光染料溴化乙錠(EB)能插入DNA分子中形成復合物，紫外光照射下EB能發射熒光，而且熒光的強度正比于核酸的含量。由于EB是致癌劑，現在開發出了安全的染料，如Syber Green、GelRed、GoldView等。【儀器與試劑】1. 儀器天平、錐形瓶、微波爐（或電爐）、制膠板、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像分析儀（或紫外線透射儀）、微量可調移液器、移液管、量筒、一次性塑料手套。2. 試劑（1）50×TAE電泳緩沖液：Tris堿24

15、2.0g、冰乙酸57.1 ml、EDTA 63.5g、NaOH 10.0g，加蒸餾水至1000 ml，使用前用蒸餾水稀釋至1×TAE電泳緩沖液。（2）6×loading buffer ：( 0.25溴酚藍，0.25%二甲苯氰FF，30%甘油水溶液)或（0.25 溴酚藍，40(w/v) 蔗糖水溶液），貯存于 4。（3）電泳級瓊脂糖（Agarose）、溴化乙錠（母液: 將EB 配制成10mg/ml，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可）、DNA Marker、DNA、蒸餾水。【實驗步驟】1配制1.5的瓊脂糖凝膠：精確稱取1.5g電泳級瓊脂糖，加入100 ml 1×TAE

16、電泳緩沖液，在微波爐里（或電爐）加熱使瓊脂糖顆粒完全溶解（加熱時應蓋上封口膜，以減少水份蒸發），待膠冷卻至55ºC左右時，加入20µl溴化乙錠（也可先不加EB，而是電泳后再用0.5µg/ml 的EB 溶液浸泡染色），輕輕旋轉混勻。插入合適的梳子，將溶液倒入制膠板中，待凝結后拔去梳子待用。2. 加樣：將凝膠置于電泳槽，加入1×TAE電泳緩沖液覆蓋膠面即可。各取PCR產物和DNA分子量參照物10 µl DNA加入1µl 6×loading buffer，混合后上樣，分別加入瓊脂糖凝膠孔內。加樣時切勿破壞點樣孔周圍的凝膠。3. 電

17、泳：合上電泳槽蓋，打開電泳儀，控制電壓保持在60-80V，電流在40mA 以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm 時，停止電泳。4. 染色：未加EB 的膠板在電泳完畢后移入0.5g/ml 的EB 溶液中，室溫下染色20-25 分鐘。5. 觀察和拍照：電泳完成后切斷電源，取出凝膠，置于凝膠成像分析儀上觀察電泳結果，并照相記錄。或在波長為254 nm的紫外燈下觀察DNA的熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩，以免損傷眼睛。 【注意事項】1影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：（1）DNA大小：遷移速率與log N成反比（N為堿基對數目）。分子越大，遷移越慢。分子量相同的空間結

18、構越緊密的電泳越快，如超螺旋>線性DNA。（2）瓊脂糖凝膠濃度：不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA ：瓊脂糖凝膠濃度可分辨的線性DNA片段大小（kb）0.5%5600.7%0.8121.0%0.461.5%0.241.75%0.232.00.13（3）DNA構象：一般遷移速率超螺旋環狀 > 線狀DNA > 單鏈開環。當條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關。（4）所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過20V/cm，電泳溫度應該低于30。（5）嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率（不提倡加在電泳液中）。（6）電泳緩沖液（0.5×TBE）的組成及其離子強度影響DNA的遷移率。無離子存在時，核酸基本不泳動；離子強度過大產熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性。一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙錠（EB）為致癌劑，