1、北京普析通用儀器有限責任公司Beijing Purkinje General Instrument Co.,Ltd.紫外可見分光光度計紫外可見分光光度計基本知識基本知識紫外-可見吸收光譜朗伯-比耳定律紫外-可見分光光度計分析條件的選擇測定方法紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS) 按所吸收光的波長區域不同，分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。 它是利用物質的分子或離子對某一波長范圍的光的吸收作用，對物質進行定性定性分析分析、定量分析定量分析及結構分析結構分析, 所依據的光譜是分子或離子吸收入

2、射光中特定波長的光而產生的吸收光譜。1 與其它光譜分析方法相比，其儀器設備和儀器設備和操作都比較簡單，費用少，分析速度快操作都比較簡單，費用少，分析速度快;2 靈敏度高靈敏度高;3 選擇性好選擇性好;4 精密度和準確度較高精密度和準確度較高;5 用途廣泛用途廣泛。 物質對光光的吸收是選擇性選擇性的，利用被測物質對某波長的光的吸收來了解物質的特性，這就是光譜法的基礎光譜法的基礎。 通過測定被測物質對不同波長的光的吸收強度（吸光度），以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得出該物質在測定波長范圍的吸收曲線吸收曲線。 在吸收曲線中，通常選用最大吸收波長max進行物質含量的測定。 2. 溶劑 注意如下幾

3、點：（1）盡量選用低極性溶劑；（2）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學和光化學穩定性；（3）溶劑在樣品的吸收光譜區無明顯吸收。3. pH值 設入射光強度為I0，吸收光強度為Ia,透射光強度為 It，反射光強度為Ir，則 I0= Ia+ It+ Ir由于反射光強度很弱，其影響很小，上式可簡化為： I0= Ia+ It一、吸光度和透光度一、吸光度和透光度透光度：透光度：透光度為透過光的強度It與入射光強度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0 三、吸光系數三、吸光系數當l以cm，c以g/L為單位，稱為吸光吸光系數系數，用 a表示。A= a cla的單位為L/(g.cm) 當l以c

4、m，c以mol/L為單位，稱為摩爾吸光系數摩爾吸光系數，用 表示。 的單位為的單位為L/mol.cm，它表示物質的，它表示物質的濃度為濃度為1mol/L，液層厚度為，液層厚度為1cm時，溶時，溶液的吸光度液的吸光度。摩爾吸光系數比吸光系數比吸光系數是指百分含量為1%， l為1cm時的吸光度值，用 表示。%11cmE%111 . 0cmrEM四、偏離朗伯-比耳定律的因素（1）入射光為非單色光）入射光為非單色光（3）光程的不一致性。）光程的不一致性。 光源不是點光源，比色皿光徑長度不一致，光學元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。 實際樣

5、品的混濁，加入的保護膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發射等，均可吸光質點的吸光特性變化大。 在紫外可見分光光度計中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源熱輻射光源和氣體放電光源 1 光源 熱輻射光源用于可見光區，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區，如氫燈和氘燈。單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準直鏡等部分。 2 單色器 單色器質量的優劣，主要決定于色散元件的質量。色散元件常用棱鏡棱鏡和光柵和光柵。 吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區。 3 吸收池 吸收池的種類很多，其光徑可在0.110cm之間，其中以1cm光徑吸

6、收池最為常用。4 檢測器 檢測器的作用是檢測光信號，并將光信號轉變為電信號。現今使用的分光光度計大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器。5 信號顯示系統 常用的信號顯示裝置有直讀檢流計，電位調節指零裝置，以及自動記錄和數字顯示裝置等。二、紫外-可見分光光度計的類型 按其光學系統可分為單波長分光光度計和雙波長分光光度計。1.單波長單光束分光光度計2.單波長雙光束分光光度計3.雙波長分光光度計代入朗伯-比爾定律有： c/c=0.4343T/TlgT要使測定的相對誤差c/c最小最小，求導取極小得出： lgT=-0.4343=A即當A=0.4343時，吸光度測量誤差最小時，吸光度測量誤差最小。 最適宜的

7、測量范圍為0.20.8之間。2.入射光波長的選擇3.狹縫寬度的選擇 為了選擇合適的狹縫寬度，應以減少狹縫寬度時試樣的吸光度不再增加吸光度不再增加為準。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。 對多種物質進行測定，常利用顯色反應將被測組分轉變為在一定波長范圍有吸收的物質。常見的顯色反應有配位反應、氧化還原反應等。這些顯色反應，必須滿足以下條件： 4.反應生成物的組成恒定。3. 反應生成的產物有足夠的穩定性足夠的穩定性，以保證測量過程中溶液的吸光度不變；2反應有較高的選擇性較高的選擇性，即被測組分生成的化合物吸收曲線應與共存物質的吸收光譜有明顯的差別；1反應的生成物必須在紫外紫外-可見

8、光區可見光區有較較強強的吸光能力吸光能力，即摩爾吸光系數較大； 測定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調節透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及吸光池和溶消除其它成分及吸光池和溶劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤差差。參比溶液的選擇視分析體系而定，具體有： 1溶劑參比溶劑參比 試樣簡單、共存其它成分對測定波長吸收弱，只考慮消除溶劑與吸消除溶劑與吸收池收池等因素； 2試樣參比試樣參比 如果試樣基體溶液在測定波長有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時，可按與顯色反應相同的條件處理試樣，只是不加入顯色劑。3試劑參比試劑參比 如果顯色劑或其它試劑在測定波長有吸收，按顯

9、色反應相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。 4. 平行操作參比平行操作參比 用不含被測組分的試樣，在相同的條件下與被測試樣同時進行處理，由此得到平行操作參比溶液。一、 單組分定量方法 單組分是指樣品溶液中含有一種組分，或者是在混合物溶液中待測組分的吸收峰與其他共有物質的吸收峰無重疊。其定量方法包括校準曲線法校準曲線法、標準對比法和吸收系數法。1 校準曲線法方法：配制一系列不同含量的標準溶液，選用適宜的參比，在相同的條件下，測定系列標準溶液的吸光度，作A-c曲線曲線，即標準曲線，也可用最小二乘數處理，得線性回歸方回歸方程程。 在相同條件下測定未知試樣的吸光度，從標準曲線上就可

10、以找到與之對應的未知試樣的濃度。2 標準對比法 即將待測溶液與某一標樣溶液，在相同的條件下，測定各自的吸光度，建立朗伯-比爾定律，解方程求出未知樣濃度與含量。 As=Kcs Ax=KcxsxsxAAcc 先用標準樣品掃描譜圖，在掃待測樣品的譜圖。拿兩者進行比較，可進行定性。但此方法誤差 比較大。 2.純度的鑒定 用紫外吸收光譜確定試樣的純度是比較方便的。 如蛋白質與核酸的純度分析中，可用A280/A260或A230/A260的比值，鑒定其純度。蛋白質濃度蛋白質濃度1552A280757.3A260(ug/ml)DNA濃度濃度62.9A26036.0A280(ug/ml)蛋白質濃度蛋白質濃度183.0A23075.8A260(ug/ml)DNA濃度濃度49.1A2603.48A230(ug/ml)3.結構分析