1、2011級細胞生物學實驗講義實驗一細胞膜通透性觀察一、實驗目的1.了解細胞膜對物質通透性的一般規律。2.了解溶血現象及其發生機制。二、實驗原理細胞膜是細胞與環境進行物質交換的選擇通透性屏障。它是一種半透膜，可選擇性控制物質進出細胞。細胞膜的通透性孔徑不會大于0.5-1.0nm，并非所有的物質都能通過。各種物質出入細胞的方式是不同的，帶電的物質通常同水結合形成一個水合的外殼，這不僅增加了它們的分子體積，同時也大大降低了脂溶性，因此帶電荷的分子（離子），不管多小，都不能自由擴散。各種非電解質進入細胞的快慢，決定于分子量的大小和極性。相對分子質量大的物質進入細胞慢，非極性分子比極性分子容易穿膜。在細

2、胞膜上有專門的水通道-水孔蛋白、和運輸特定物質的載體蛋白，它們的運輸方式為易化擴散。水是生物界最普遍的溶劑，水分子可以按照物質濃度梯度從滲透壓低的一側通過細胞膜向滲透壓高的一側擴散，這種現象就是滲透。滲透作用是細胞膜的主要功能之一。將紅細胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細胞內，可使細胞脹破，血紅蛋白釋放到介質中，由不透明的紅細胞懸液變為紅色透明的血紅蛋白溶液，這種現象稱為溶血。將紅細胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細胞膜對各種溶質的通透性不同，膜兩側的滲透壓平衡會發生改變，也會發生溶血現象。各種非電解質溶液，只要單位面積中所含的分子數相同，就具有相同的滲透壓。將紅細胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖

3、等摩爾濃度的高滲液中，分子進入紅血細胞，導致水的攝入，使細胞膨脹、破裂發生溶血。溶血現象發生的快慢與進入細胞的物質的分子量有關，相對分子質量大的進入細胞慢，發生溶血所需的時間也長。因此，發生溶血現象所需時間長短可作為測量物質進入紅細胞速度的一種指標。本實驗選用紅細胞作為細胞膜透性的實驗材料，將其放入不同的介質溶液中，觀察紅細胞的變化。二、實驗儀器、材料和試劑1、儀器、用具：小燒杯、試管、試管架、刻度吸管、秒表。2、材料：含適量阿氏液的雞血或兔血。3、試劑：(1)各種待測溶液：1mol/L乙二醇水溶液、1mol/L丙三醇水溶液、1mol/L葡萄糖水溶液、3mol/L甲醇、3mol/L乙醇、3mo

4、l/L丙醇、1/8mol/L、1/10mol/L、1/12mol/Lmol/L葡萄糖水溶液、1/8mol/L、 1/12mol/L、1/16mol/LNaCl溶液。(2)阿氏液（Alsever液）,配方如下： 枸櫞酸鈉(Na9C6H5O7.2H2O).0.80g 枸櫞酸（C6H 6O7.H2O）. 0.325g 葡萄糖 2.05g 氯化鈉.0.42g H2O 加至100.00ml混勻溶解后，114.3高壓滅菌，10min備用。阿氏液即含有枸櫞酸鈉抗凝劑，又含有細胞生存的營養，所以它即可做細胞的抗凝劑，又可做細胞的保存液。阿氏液和采血量為1：1，一般在4下紅細胞可保存2周其活性和特性不變。三、方

5、法與步驟取12支試管，按附表中所示測試溶液，分別取樣各2ml，作出標記后，各管均加入紅細胞懸液2 滴，混勻后靜置于溫室中，觀察各支試管中發生溶血的時間及其變化。四、觀察結果1. 試管內液體分兩層：上層淺黃色透明，下層紅色不透明為不溶血（），鏡檢紅細胞完好呈雙凹盤狀。2. 如果試管內液體混濁，上層帶紅色者，稱不完全溶血（或），鏡檢有部分紅細胞呈碎片。3. 如果試管內液體變紅而透明者，稱完全溶血（），鏡檢發現細胞全部呈碎片。五、注意事項1、試管中有紅細胞和測試溶液時，不應強力搖晃，以免造成人為的紅細胞破裂。2、紅細胞和測試溶液混勻后，應靜置于溫室中，不要再次搖動，避免人為的分層渾濁。六、作業附表：

6、各種溶液的溶血現象觀察結果編號待測溶液是否溶血時間分析原因11mol/L乙二醇水溶液21mol/L丙三醇水溶液31mol/L葡萄糖水溶液43mol/L甲醇53mol/L乙醇63mol/L丙醇71/8mol/L葡萄糖水溶液81/10mol/L葡萄糖水溶液91/12mol/L葡萄糖水溶液101/8mol/LNaCl溶液111/12mol/LNaCl溶液121/16mol/LNaCl溶液目測法判斷標準：快速溶血：；慢速溶血：或；不溶血：七、思考題為什么所有帶電荷的分子（離子），不管多小，都不能自由擴散？八、課后習題（一） 概念題1、 滲透作用: 水分子可以按照物質濃度梯度從滲透壓低的一側通過細胞膜向

7、滲透壓高的一側擴散，這種現象就是滲透2、 溶血: 將紅細胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細胞內，可使細胞脹破，血紅蛋白釋放到介質中，由不透明的紅細胞懸液變為紅色透明的血紅蛋白溶液，這種現象稱為溶血。（二） 選擇填空題1、將紅細胞放在低滲鹽溶液中，會發生（ ）A、水分子流出細胞 B、水分子既不進入，也不流出細胞 C、水分子流入、流出細胞的速度相等 D、溶血2、將紅細胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩爾濃度的高滲液中，會發生（ ）A、水分子流出細胞 B、水分子既不進入，也不流出細胞 C、水分子流入、流出細胞的速度相等 D、溶血（三）填空題1、將紅細胞放在低滲鹽溶液中，會發生（ ）。2、將紅細胞置于

8、乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩爾濃度的高滲液中，溶血現象發生的快慢與進入細胞的物質的分子量有關，具體為（ ）。（四）問答題1、為什么所有帶電荷的分子（離子），不管多小，都不能自由擴散？2、為什么把紅細胞放入葡萄糖高滲液中也會發生溶血？3、為什么把紅細胞放入低滲或某些等滲的鹽溶液中會發生溶血？（五）分析題1、水能使血紅細胞發生溶血，而且幾乎瞬時的，試從細胞物質運輸的機制的角度分析這一現象產生的原因。2、等滲的草酸銨和氯化銨均能使紅細胞發生溶血，但草酸銨使紅細胞發生溶血的速度比氯化銨要快，試從化學物質電離平衡和細胞物質運輸的機制的角度分析這一現象產生的原因。實驗二線粒體和液泡系的超活染色與觀察一、實驗

9、目的1、觀察動植物活細胞內線粒體、液泡系的形態數量與分布；2、學習一些細胞器的超活染色技術。二、實驗原理活體染色是指對生活有機體的細胞或組織能著色，但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細胞內的某些結構，而不影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以致引起細胞的死亡。活染技術可用來研究生活狀態下的細胞形態結構和生理、病理狀態。根據所用染色劑的性質和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內活染與體外活染二類。體內活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內，染料的膠體固定，堆積在細胞內的某些特殊結構里，達到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料

10、溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色。活體染料之所以能固定、堆積在細胞內某些特殊部分，主要是染料的電化學特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽粒子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是有陰離子或陽離子，這樣它們彼此之間就發生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑使用，應選擇那些對細胞無毒性或毒性較小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料最為適合，可能是因為它具有溶解在類脂類(卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于細胞吸收。但不是任何染料都可作為活體染色劑使用,一般應選擇那些毒性小的堿性染料(易溶于類脂質)并配成較稀的溶液來使用。詹納斯綠這種堿性染料

11、是活體染色中重要的染料，對線粒體的染色有專一性，可專一性地對對線粒體進行活染,這是由于線粒體內的細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(即有色狀態)，呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質中，這些染料被還原為無色的基團。從20世紀初到30年代，法國細胞學家Guilliermond、Dangeard和Parat用活體染色的方法，研究了植物和動物的液泡，提出了液泡系這個名詞。當時認為凡是用活體染色的方法，能染上中性紅的小泡都屬于液泡系。而染不上的小泡被稱為圓球體。現在認為在細胞內，凡是由膜所包圍的小泡或液泡，除線粒體、質體外，都屬于液泡系，包括圓球體。中性紅為弱堿性染料，對高爾基液泡系的染色有專一

12、性，只將活細胞中的液泡系染成紅色，這可能是與液泡系中蛋白質有關。三、實驗儀器、材料和試劑1、儀器、用具：顯微鏡、解剖盤、剪刀、鑷子、解剖刀、吸管、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、吸水紙。2、材料：洋蔥鱗莖、人口腔上皮細胞3、試劑：1）Ringer溶液 氯化鈉                       .g（變溫動物用0.65g） 氯化鉀    

13、                   .g 氯化鈣                       .g 蒸餾水 1 ml2）1% 和1/3000中性紅溶液： 稱取0.5g中性紅溶于50ml Ringer

14、液,稍加熱(30-40)溶解,用濾紙過濾,裝入棕色瓶中于暗處保存。 臨用前，取1% 原液1ml加入29ml Ringer溶液,即得1/3000工作液,將其裝入棕色瓶中備用。3）1% 和1/5000詹納斯綠溶液 稱取0.5g詹納斯綠溶于5ml Ringer溶液中,稍加熱(30-40)溶解,用濾紙過濾后（可省略）,即為1%原液。 取1%原液1ml加入49mlRinger溶液,即得1/5000工作液,將其裝入棕色瓶中備用.最好現配現用,以保持充分的氧化能力。四、方法與步驟（一）液泡系的活體染色與觀察1、口腔上皮細胞的液泡系活體染色觀察 1)用牙簽的鈍的一頭刮取口腔黏膜，放入載玻片上1/3000中性紅

15、染液滴中，染色510分鐘。 2)用吸管吸去染液，滴加Ringer液，蓋上蓋玻片進行觀察。 3)在高倍鏡下可見口腔上皮細胞為扁平、不規則形，細胞核及核仁清楚可見，在細胞核上方胞質中，有許多被染成玫瑰紅色大小不一的泡狀體，這一特定區叫“高爾基區”，即液泡系。2、植物細胞液泡的活體染色 1）撕取洋蔥鱗莖內表皮，放入載玻片上1/3000中性紅染液滴中，染色510分鐘。 2）用吸管吸去染液，滴加Ringer液，蓋上蓋玻片進行觀察。 3）可見到被染成磚紅色的中央大液泡。（二）線粒體的活體染色與觀察1、動物細胞線粒體活體染色的觀察 1) 滴12滴1/5000詹納斯綠B，用牙簽的鈍的一頭刮取口腔黏膜，涂片，加

16、蓋玻片，染色10分種后觀察。 3）鏡檢：可見口腔上皮細胞中的線粒體染成藍綠色，呈顆粒狀或線條狀，在細胞核周圍分布特別多、大。2、植物細胞線粒體的活體染色 1）用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴在干凈的載玻片上，用鑷子撕取洋蔥鱗莖內表皮一小塊，置于染液中，染色1015分鐘。2）吸去染液，加一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，鏡檢。在高倍鏡下，可見表皮細胞中央被一大液泡占據，細胞核被擠至旁邊，線粒體染成藍綠色，呈顆粒狀或線條狀。五、觀察注意事項1、線粒體具有折光性。2、線粒體在細胞的分布常不均勻。六、結果與分析1、簡述線粒體詹納斯綠B活體染色的原理。2、繪出口腔上皮細胞示線粒體的形態與分布。七、

17、課后習題（一） 概念題（每題5分）1、 超活染色2、 液泡系3、 活體染色4、 圓球體（二） 選擇填空題（每題1分）1、詹納斯綠專一性地對對線粒體進行活染是由于線粒體內的( )的作用。A、細胞色素氧化酶系 B、氧化磷酸化 C、質子驅動力 D、pH差2、液泡系中（ ）能被中性紅染色。A、高爾基液泡 B、活細胞中所有液泡 C、植物細胞中所有小泡 D、圓球體（三）填空題（每空2分）1、活體染色劑選擇那些（ ）染料，而且總是要（ ）來使用。2、活體染料之所以能固定、堆積在細胞內某些特殊部分，主要是染料（ ）起重要作用。3、中性紅對（ ）的染色有專一性，而且只將（ ）染成紅色（四）問答題（每題10分）1

18、、為什么詹納斯綠B能專一性地對線粒體染色？2、詹納斯綠B能染死細胞嗎？為什么？3、為什么活體染色劑一般應選擇那些毒性小的堿性染料并配成較稀的溶液來使用？實驗三 胞間連絲的觀察一、實驗目的觀察植物細胞的胞間連絲，了解其意義。二、實驗原理胞間連絲是高等植物之間貫穿細胞壁、溝通相鄰細胞的細胞質連線。為細胞間物質運輸與信息傳遞的重要通道。胞間連絲與動物細胞的間隙連接有許多相同之處。正常情況下它允許1000道爾頓以下的分子滲透，也能讓離子自由通過。與間隙連接不同的是,胞間連絲的孔能夠擴張，允許大分子，包括蛋白質和RNA分子通過。胞間連絲有相互連接的相鄰的細胞質膜共同組成的直徑2040nm的管狀結構，中央

19、是由內質網延伸形成的鏈狀結構。初生胞間連絲是高爾基器小泡融合成細胞板時，因被伸入于其間的內質網膜阻止其融合而形成的；次生胞間連絲是由一些降解酶（果膠酶、半纖維素酶和纖維素酶）的作用使完整的細胞壁穿孔而成。胞間連絲見于所有的高等植物、某些低等植物如有些藻類以及真菌。在有胞間連絲的植物中，大多數細胞間都有胞間連絲，胞質可在其間流動，使整個植物體成為共質體。大多數細胞間都有胞間連絲，但在某些成熟細胞之間有時并不存在這種結構，如蠶豆、洋蔥氣孔保衛細胞之間的壁上就沒有。一個沿縱向排列的細胞，其橫向壁上出現的數目常高于縱向壁。胞間連絲的數目可以多至平均每平方微米140個。胞間連絲是一種動態結構，它不僅是細

20、胞板形成后保留的結構，而且還能次生增添。在光學顯微鏡下觀察胞間連絲一般均需將標本先經膨脹和染色處理，常用的處理液為盧戈爾氏液（1碘溶在2碘化鉀溶液中）。只有少數植物如馬錢子、海棗、柿子和歐洲七葉樹種子的胚乳和子葉細胞標本可不經處理直接看到胞間連絲。三、實驗用品1、器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、解剖刀、刀片、鑷子、剪刀。2、試劑：3、材料：紅辣椒、玉米籽粒、洋蔥四、實驗方法（一）紅辣椒表皮細胞的臨時裝片取一小塊紅辣椒，用刀片小心刮除果肉，留下一層極薄的表皮，放于載玻片上，封片觀察，鏡檢時光線不要太強。（二）玉米種子糊粉層臨時裝片將玉米種子在水中浸泡一天，用鑷子剝去表皮，露出糊粉層，這時可以用鑷子

21、輕撕糊粉層放于水中或制作徒手切片，刀片與糊粉層平行，切極薄片，封片觀察。（三）洋蔥內表皮細胞觀察撕洋蔥內表皮一小塊，0.5%番紅染色23分鐘，沖洗，封片觀察，多余水用吸水紙吸干。五、注意事項取一洋蔥(Allium cepa L.)鱗莖,縱剖幾瓣,剝下一片成熟適度的鱗片葉，從其凹下的一面用刀片劃一個3mm的"井"字刻痕，然后用尖頭鑷子輕輕刺入表皮層，用鑷子夾住表皮朝一個方向撕下(凹面的表皮較易撕下,有時凸面也可以用)，將撕下的表皮迅速放在滴有水滴的載玻片上，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的水分。撕表皮時要注意:撕時操作要迅速，勿將撕下的表皮在空氣中暴露過久，致使活細胞因失水而受

22、到損傷。撕開的一面最好朝上放在載玻片上，以利于染色觀察。撕下的表皮一定要平鋪在有水的載玻片上，如發生褶皺或重疊，可用解剖針將其平鋪，并除去氣泡，褶皺和重疊都會影響觀察效果。六、習題（一）概念題1、胞間連絲（二）填空題1、在光學顯微鏡下觀察胞間連絲一般均需將標本先經（ ）處理，常用的處理液為（ ）。2、在玉米種子糊粉層臨時裝片的操作時，先（ ），再（ ），然后（ ），最后封片觀察。（三）選擇填空題1、下面關于胞間連絲的敘述正確的有A、胞間連絲是高爾基器小泡融合成細胞板時，因被伸入于其間的內質網膜阻止其融合而形成的B、胞間連絲是由一些降解酶（果膠酶、半纖維素酶和纖維素酶）的作用使完整的細胞壁穿孔而

23、成。C、胞間連絲由相互連接的相鄰的細胞質膜共同組成D、胞間連絲允許大分子，包括蛋白質和RNA分子通過。實驗四魚肝細胞的分離一、實驗目的1、了解細胞分離的技術2、掌握一種肝細胞分離的基本方法,學習細胞消化，細胞計數二、實驗原理使細胞離散成單個細胞的溶液，經常使用的有胰蛋白酶、膠原酶和EDTA。 EDTA是一種化學螯合劑，它對細胞有一定的解離作用。一些組織，尤其是上皮組織，在生長過程中需Ca2和Mg2維持組織的完整性，EDTA從細胞生存環境中奪取這些離子，形成螯合物，從而使細胞分離。因此可用EDTA來破壞一些細胞之間的連結，從而達到分離細胞的目的。本實驗通過三種方法分離魚類肝細胞（機械分離法、循環

24、灌注法、胰酶法）獲得可用于肝細胞原代培養的細胞分離物。三、實驗材料鯽魚的新鮮肝臟四、試劑和器材吸管、離心機、冰、無菌鑷子、無菌剪刀、超凈工作臺、無菌鈍頭玻璃棒。配置的緩沖液需要做濾菌處理。五、實驗步驟先消毒處理：1、取暫養1d后的實驗魚，于0.01%（w/v）的高錳酸鉀中浸泡30min，75%浸泡1min，MS-222麻醉，采血。2、無菌條件下，剪開腹部取出肝組織，用冷DBSS洗三遍（加以輕壓，除去血細胞）。除去血細胞和其他組織。方法一 機械分離法1、打開腹部后，先用滅菌的冷的DBSS洗。然后把肝臟剪成1.02.0mm的小塊。2、小塊用DBSS洗三次（加以輕壓，除去血細胞），用鑷子夾成更小的片

25、段。3、把這些小片段置于不銹鋼網篩上（孔徑0.3mm），然后輕柔地磨壓，使之通過網篩。4、收集組織懸浮液，然后置于另一個網篩上（孔徑0.075mm），然后輕柔地磨壓，使之通過網篩。5、以120g離心，收集肝細胞。6、用培養基（加入10%小牛血清的DMEM、M199或L-15）重懸，然后離心，共三次。7、用含100UmL-1青霉素和100gmL-1相同的培養基洗兩次。8、用血球計數器計算產量。9、用臺盼藍拒染法評估細胞活力。（見原生質體的制備和活力檢測）方法二 灌注法1、打開腹腔，結扎肝門靜脈（有膽囊一側的大血管），原位用Buff以2ml/min的流速灌注。2、當血液清洗干凈后，用Buff以5m

26、l/min流速灌注。3、在膠原酶酶解后，將肝轉入含培養基（加入10%小牛血清的DMEM、M199或L-15）的培養皿中。4、用鑷子測試消化的效果，并在冰上輕柔振蕩30min。5、細胞然后被分散，并用網篩（孔徑0.075mm）過濾。120g轉速離心，收集濾液。以下同方法一的6、7、8、9步。方法三1、打開腹部后，先用滅菌的冷的DBSS洗。然后把肝臟剪成1.02.0mm的小塊。2、小塊用DBSS洗三次（加以輕壓，除去血細胞），用鑷子夾成更小的片段。3、在培養皿中加入0.1%的胰酶消化液，消化肝片段30min，在消化過程中用吸管輕柔吹吸消化液。4、用不銹鋼濾網將消化的片段濾入培養液（加入10%小牛血

27、清的DMEM、M199或L-15）。5、以120g離心，收集肝細胞。以下同方法一的6、7、8、9步。注意事項：1、注意無菌操作。2、注意低溫下進行。3、機械處理會損傷肝細胞。六、作業1討論實驗中EDTA對實驗的影響2簡述分離肝細胞應注意的事項3繪肝細胞圖七、課后習題（一）概念題1、細胞黏著2、細胞連接3、細胞基質（二）選擇填空題1、用EDTA處理肝細胞時，EDTA會從環境攝取（ ），從而破壞了細胞與細胞，細胞與細胞基質間的黏著和連接A、金屬離子 B、細胞基質 C、粘連分子 D、硫酸根2、動物細胞分離消化液中有下列組分A、胰蛋白酶 B、膠原酶 C、EDTA D、Mg2+ E、Ca2+（三）問答題

28、1、在動物細胞分離實驗中組織消化液為什么要加EDTA？2、分離動物細胞有哪些方法？分離動物細胞應該注意哪些事項？3、用于原代培養的動物細胞的分離，應該注意哪些事項避免雜菌污染？實驗五 福爾根染色一、 背景及實驗原理組織化學反應的原理是利用某些試劑能夠與待檢物質的特有基團發生特異性結合，從而通過細胞中該試劑存在的部位和顏色（或沉淀）的深淺，間接地顯示出待檢組分的分布與含量。福爾根反應（Feulgen reaction）是Feulgen和Rossenbeck于1924年創立的特異性顯示DNA的經典方法。該方法主要包括水解和顯色兩個步驟：將脫氧核糖核酸用鹽酸脫嘌呤，其暴露出的自由醛基可與Schiff

29、試劑發生反應呈現出紫紅色，此即福爾根反應。細胞中除了DNA酸解會產生醛基外，多糖等物質也會產生醛基，此外，細胞中可能還有自由醛基。但是多糖的醛基不會裸露，而自由醛基則可被鹽酸消除。RNA的N-糖苷鍵較為穩定，在Feulgen反應的酸解條件下，其嘌呤堿基不易脫出。故只有DNA不完全水解暴露出來的醛基才能與Schiff試劑反應產生紫紅色產物。由于線粒體、葉綠體的結構原因，內部的DNA也不被染色。因此Feulgen反應是對細胞中核DNA高度專一的檢測手段。歷史上，Feulgen染色法用于細胞核DNA含量倍性分析，可以說迄今仍然是DNA定量分析的一種有效的候選方法。目前Feulgen染色常用于宮頸切片

30、、快速石蠟切片、組織印片的快速病理診斷過程中，細胞中DNA的含量及倍性分析可為判斷腫瘤之良惡性提供參考數據。二、 實驗目的1、以Feulgen染色法為例，學習細胞化學方法檢測細胞核DNA的原理和方法。2、觀察DNA在細胞內的分布。三、實驗材料、儀器與試劑1、實驗材料洋蔥鱗莖2、實驗儀器水浴鍋、25ml燒杯2個、吸管、廢液缸、吸水紙、載玻片、蓋玻片、小鑷子和顯微鏡等。3、實驗試劑5% 三氯乙酸1 mmol/L HCl：取密度為1.18的濃鹽酸82.5ml，加蒸餾水至1000ml。Schiff試劑：取200ml水煮沸，離火放入1g堿性品紅（basic fuchsin），充分攪拌使其充分溶解，待冷至

31、55時過濾，裝入棕色瓶中，加入1mol/L HCl 20ml，冷卻至25時，加入1g偏重亞硫酸鈉（NaS2O3）或者偏重亞硫酸鉀（K2S2O3），蓋緊瓶塞后充分振蕩，然后蓋緊靜置數日，待溶液紅色褪去，呈現無色或淡黃色時，加入0.5g活性炭，劇烈振蕩后用粗濾紙過濾，得到的無色溶液即可使用。存放時，密封瓶口并用黑布遮閉容器以避光，藏于冷暗處（如冰箱4），可保數月或者更長時間，當液體再次變紅時就不能使用。亞硫酸水10%偏重亞硫酸鈉（或鉀）水溶液5ml，蒸餾水100ml，1mol/L HCl 5ml混合搖勻，蓋緊瓶塞。此溶液宜現配現用，SO2逸出后則會失效。四、實驗方法與步驟1、撕取小塊洋蔥內表皮，放

32、入10ml預熱60的1mol/L HCl中溫浴水解810min。2、自來水漂洗表皮5min。3、Schiff試劑避光浸染30min。4、用新鮮配制的亞硫酸水10ml漂洗2次，每次1min。5、自來水漂洗5min。6、將表皮平鋪于載玻片上，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察。7、對照實驗：對照1：標本不經水解直接放入Schiff試劑中染色。對照2：標本在HCl水解前，先用5%三氯乙酸90處理15min，破壞材料中的DNA，其余步驟相同。五、注意事項1、稀鹽酸水解是Feulgen反應中的重要步驟，水解時間對實驗結果有重要影響。如水解時間不夠，DNA的嘌呤堿基脫落和醛基的釋放量不足，反應較弱；但水解時間過長、

33、過度酸解，也會使DNA鏈斷裂而流失到胞質中，也會造成反應較弱。通常影響水解時間的主要因素包括：組織類型、固定液種類、酸解液濃度、酸解溫度等，通常60 1mol/L HCl中水解時間為812分鐘。2、染色結束后應該進行充分漂洗，否則殘留在細胞中的Schiff試劑，一旦轉入蒸餾水中會立即變紅，而使細胞核外其余部分出現非特異染色，導致DNA檢測的誤差。六、思考題1、對照實驗中，標本不經水解直接放入Schiff試劑中染色，如果染色時間過久，會出現什么現象？2、染色后用亞硫酸水漂洗有何目的？七、課后習題（一） 概念（每題5分）1、 福爾根反應2、 細胞組織化學反應（二） 選擇填空題（每空1分）1、Sch

34、iff試劑能與暴露出的（ ）反應，產生紫紅色。A、磷酸基團 B、巰基 C、自由醛基 D、酰基2、在福爾根反應中，核DNA經稀鹽酸水解后，會發生（ ），從而暴露出自由醛基。A、脫嘌呤 B、脫嘧啶 C、脫堿基 D、磷脂鍵的斷裂3、在福爾根反應中，RNA在稀鹽酸水解條件下，其（ ）比較穩定，不會發生脫嘌呤。A、糖苷鍵 B、磷脂鍵 C、核糖 D、堿基4、由于線粒體、葉綠體特殊的結構，其DNA( )與Schiff試劑反應A、會 B、不會 C、在過度水解時會 D、在不完全水解時會（三）填空題（每空2分）1、稀鹽酸水解是Feulgen反應中的重要步驟，水解時間對實驗結果有重要影響。如水解時間不夠，DNA（

35、），反應較弱；但水解時間過長、過度酸解，DNA（ ），也會造成反應較弱。2、在進行福爾根反應時，如果材料經Schiff試劑染色后，直接用蒸餾水漂洗，Schiff試劑（ ）。（四）問答題1、在進行福爾根反應時，如果標本不經水解直接放入Schiff試劑中染色，會發生什么現象？為什么？2、在進行福爾根反應時，標本在HCl水解前，先用5%三氯乙酸90處理15min，其余步驟相同，會發生什么現象為什么？3、染色后用亞硫酸水漂洗有何目的？實驗六 性染色質小體的觀察一、實驗目的1、掌握人體性染色質的檢測方法。2、觀察人體性染色質的形態特征及存在部位。3、了解雌性哺乳動物X染色體失活假說和劑量補償效應的機制。

36、二、實驗原理1949年M.L.Barr等研究發現雌貓神經細胞核膜內凝縮的深染小體，性染色質體(sex-chromatin body)或巴氏小體(Barr body)，而雄性個體細胞中則沒有。進一步研究發現：所有哺乳類雌體細胞中都可以見到這一結構。巴氏小體是由雌性哺乳動物體細胞中失活的X染色體在間期細胞核中呈異固縮狀態（染色質高度螺旋化），形成直徑約1m，貼近于核膜邊緣的染色小體。X-染色質的形態表現為一結構致密的濃染小體；輪廓清楚；大小11.5m；常附著于核膜邊緣或靠近內側；形狀為凸形、三角形、卵形、短棒及雙球形等。正常女性口腔黏膜細胞中出現率：30 50%。在正常女性細胞中僅可觀察到一個巴氏

37、小體，而正常男性細胞中無巴氏小體或僅有個別細胞中有不典型的巴氏小體。這是由于正常女性具有兩條X染色體，而正常男性細胞僅有一條X染色體，女性細胞中的X染色體中其中一條染色體隨機失活，從而形成了巴氏小體，以保證細胞中的能活躍進行基因表達的X染色體只有一條。這就是所謂的雌性哺乳動物X染色體失活假說和劑量補償效應。巴氏小體屬于兼性異染色質，是在胚胎發育早期，X染色體隨機失活引起的。故而在間期，巴氏小體復制時間比有活性的X染色體稍遲一些，被正在復制的常染色質推向細胞核的邊緣。因此巴氏小體在間期常處于核膜的邊緣。細胞分裂期可形成正常的染色體形態。三、實驗用品1、器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、牙簽、解

38、剖針等。2、試劑：改良苯酚品紅、60%醋酸、45%冰醋酸、95%乙醇3、實驗材料：女生口腔黏膜細胞（男生為對照）；女生毛囊細胞（男生為對照）四、實驗操作1、口腔頰部粘膜細胞巴氏小體觀察（1）取干凈載玻片，用記號筆在將涂細胞的一面右上角做好標記；（2）嗽口（三次），盡可能除去口中雜物；（3）用牙簽刮取頰部粘膜上皮細胞，棄第一次刮取物，在同一部位繼續刮取；（4）將刮得的細胞涂在干凈載玻片上，反復幾次，使玻片上的材料盡可能多些（每人做2張，1張女生的，1張男生的）；（5）空氣中干燥；（6）涂片區滴上100l的60%冰醋酸固定5分鐘；（7）吸去冰醋酸，滴20l改良苯酚品紅染色2分鐘；（8）壓片；（9）

39、鏡檢。2、發根細胞巴氏小體觀察拔取帶毛囊頭發一段，置于載玻片上 滴100l 45%乙酸解離5分鐘后，吸掉 乙酸解剖針剝取 外層毛囊細胞，在 載玻片上將組織細胞均勻攤平晾干 滴上100l 改良苯酚品紅染色10分鐘吸去染液，滴 100l 95%乙醇分 色，1分鐘后吸掉壓片鏡檢。五、X-染色質的辨認1、先用低倍鏡觀察低倍鏡下檢出典型的可數細胞的標準：核質是網狀或細顆粒狀分布；核膜清晰、核無缺損；染色適度；周圍無雜菌。2、再在高倍鏡或油鏡下進一步觀察。注意：在女性間期細胞核內側靠近核膜處有約1微米大小的反光極強的顆粒狀亮點，即為巴氏小體。材料不同，觀察結果可能有不同，且必須和核仁區別開來（核仁往往離核

40、膜較遠或接近核中央部位）。六、注意事項1、刮口腔上皮細胞前要漱口；2、涂片略干再加改良苯酚口紅；3、染色時間不要太長，否則核質著色深，X染色質體不易區分；4、毛囊細胞要充分解離，壓片前可先用解剖針敲片，使細胞解離。六、作業分別觀察男女各50個可數細胞，計算顯示X染色質所占百分比。（正常女性口腔粘膜細胞中約3050%有一個巴氏小體，男性則低于12%）。觀察中選繪45個典型細胞，示明X染色質小體的形成和部位。七、思考題1、什么是劑量補償效應？2、為什么巴氏小體一般出現在核膜邊緣？3、巴氏小體在人類遺傳學工作中有什么用途？八、課后習題（一）概念題1、巴氏小體2、X染色體失活假說和劑量補償效應（二）選

41、擇填空題1、在44+XO組型的女人的細胞中，可以觀察到（ ）個巴氏小體A、0個 B、1個 C、兩個 D、難以確定2、在44+XXY組型的男人的細胞中，可觀察到（ ）個巴氏小體A、0個 B、1個 C、兩個 D、難以確定（三）填空題1、巴氏小體在間期細胞細胞復制時間（ ）。2、巴氏小體屬于（ ）染色質。（四）問答題1、為什么巴氏小體一般出現在核膜邊緣？2、巴氏小體在人類遺傳學工作中有什么用途？實驗七、葉綠體的密度梯度離心一、 實驗原理密度梯度離心是將要分離的細胞組分小心地鋪放在密度逐漸增加的、高溶解性的惰性物質（如蔗糖）形成的密度梯度溶液的表面，通過重力或離心力的作用使樣品中的不同組分以不同的沉降

42、速率沉降，形成不同的沉降帶。密度梯度離心常用的介質有蔗糖、多聚蔗糖和氯化銫等。此類離心又可分為速度沉降和等密度沉降兩種。所謂速度沉降是在離心前將要分離的細胞勻漿物放置在蔗糖梯度溶液的上層，各種細胞組分根據它們的大小以不同的速度沉降，形成不同的沉降帶，然后分別收集不同沉降帶中的組分。等密度沉降是細胞組分在連續梯度的高密度介質中經離心力場長時間的作用沉降或漂浮到與自身密度相等的位置，形成不同的密度區帶。本實驗采用兩種濃度的蔗糖溶液制成梯度，在離心條件下，葉綠體和比它沉降系數小的細胞組分聚集到梯度交界處，而沉降系數較大的細胞組分沉到離心管底部，此法可以粗分或富集葉綠體。葉綠體是植物細胞所特有的進行光

43、合作用的細胞器，分離完整葉綠體主要有三個困難：植物細胞被堅韌的細胞壁包圍。破碎細胞既要足以打破細胞壁又要保證葉綠體的完整；葉綠體中由淀粉累積而成的致密顆粒會在離心過程中使葉綠體破碎；勻漿過程中，液泡中貯存的有毒物質（如水解酶等）會釋放出來，破壞葉綠體。菠菜和豌豆嫩葉是分離完整葉綠體的極好材料，其細胞中所含葉綠體小，而且都能在不積累淀粉和酚類物質的條件下生長。菠菜的葉綠體/濕重比率高，而豌豆容易生長。二、實驗目的1、 掌握葉綠體分離技術；2、 掌握密度梯度離心的原理和注意事項三、實驗材料、儀器與試劑1、實驗材料新鮮菠菜2、實驗儀器普通光學顯微鏡、普通離心機和臺式冷凍離心機等。研缽、剪刀、托盤和玻

44、皿。3、 實驗試劑勻漿介質（0.25mol/L蔗糖、0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4）：稱取85.55g蔗糖，6.05g Tris溶解在800ml蒸餾水中，加入約4.25ml 0.1mol/L HCl，最后蒸餾水定容至1000ml。50%蔗糖溶液、15%蔗糖溶液。四、實驗方法與步驟1、洗凈菠菜葉，盡可能使它干燥，去葉柄、主脈后，稱取23g剪碎。2、加入預冷到近0的勻漿介質10ml，在組織搗碎器上選高速檔搗碎2min或冰上用研缽研磨。3、搗碎葉用雙層紗布過濾到燒杯中。4、將濾液移入2ml離心管，500r/min離心10min，輕輕吸取上清液。5、在1.5ml離心管內依次加入

45、50%蔗糖溶液和15%蔗糖溶液各0.4ml。注意15%蔗糖溶液沿離心管緩緩注入，不能攪動50%蔗糖液面。密度梯度制好后可見兩種溶液界面處折光有所不同。6、小心地沿離心管壁加入0.4ml上清液。7、用水平轉頭離心8000r/min，20min。8、取出離心管，可見葉綠體在密度梯度液中間形成帶。9、用滴管輕輕吸取一滴葉綠體滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在普通顯微鏡下觀察：在普通光學顯微鏡下，可看到綠色橄欖型葉綠體，在高倍鏡下看到葉綠體內部含有深綠色基粒。五、思考題1、分離的葉綠體是否純凈？試分析原因。2、勻漿介質為什么選用0.25mol/L蔗糖？勻漿在低溫下快速進行是何道理？六、課后習題（一）概念題1

46、、密度梯度離心2、速度沉降3、等密度沉降（二）選擇填空題1、下列哪種物質可作為密度梯度離心選用的梯度介質？（ ）A、高溶解性的物質 B、低溶解性的物質 C、高溶解性鹽 D、高溶解性的惰性鹽2、在提取葉綠體時，可能造成葉綠體破壞的可能的原因為（ ）A、葉綠體中的淀粉 B、葉綠體中的脂肪 C、細胞中的酚類物質 D、細胞中淀粉（三）填空題1、勻漿過程中，液泡中貯存的（ ），破壞葉綠體。2、菠菜和豌豆嫩葉是分離完整葉綠體的極好材料，因為（ ）。（四）問答題1、在密度梯度離心提取葉綠體時，勻漿介質為什么選用0.25mol/L蔗糖？勻漿在低溫下快速進行是何道理？2、在密度梯度離心提取葉綠體時，采用兩種濃度

47、的蔗糖溶液（50%和15%）制成梯度，分離的葉綠體是否純凈？試分析原因。實驗八 植物細胞原生質體分離及活力檢測一、實驗目的 1、了解植物原生質體的有關知識 2、學習酶法分離植物原生質體的方法二、實驗原理原生質體（Protoplast）:指采用機械或酶解法去掉細胞壁的裸露細胞 。原生質體分離的最基本原則是保證原生質體不受傷害及不損害它的再生能力。原生質體分離的方法包括：1、 機械法分離。 缺點是：產量極低；應用的材料受限制；操作極費力。2、酶法分離。Cocking最早開展這方面研究，克服了機械法分離的缺陷。酶法可在短時間內獲得大量原生質體，缺點是：不純的酶制劑所含雜質對原生質

48、體可能有不同程度的毒害作用。酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁，即可得到原生質體。酶法分離原生質體應當考慮取材、酶的種類和純度、酶液的滲透壓、酶解時間及溫度等因素對分離原生質體的影響。原生質體操作需要在一定滲透壓存在下進行，常用的配制分離原生質體酶液的溶液以及洗滌原生質體的溶液為CPW液。 由于原生質體內部與外界環境之間僅隔一層薄薄的細胞膜，必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性。多數情況下，甘露醇是常用的滲透劑，可能是由于它的鈍性及擴散入原生質體的速度很慢的

49、緣故，這樣一來能保證一個穩定的滲透壓。同時，保證一定的pH值是分離高活力原生質體的重要保證。MES（2-（N-嗎啉代）乙磺酸）是理想的分離原生質體緩沖液的標準，原因是：1. pKa位于中性范圍；2. 水溶性好，且不易溶于其他溶劑；3. 不易螯合鹽離子；5. pKa不受溫度變化的影響；6. 穩定。鈣、鎂離子很重要，可以維持細胞膜的穩定性。植物原生質體的純化的方法：1、離心沉降法：收集方便，但仍有雜質；2、漂浮法：原生質體浮于比重大、滲透壓高的溶液表面。可以收集較純的原生質體，但數量少。將酶解的原生質體與蔗糖溶液（23%左右）混合。3、界面法：使原生質體處于兩種比重不同的的溶液（如蔗糖、甘露醇）界

50、面之中。可以得到較純的原生質體，但操作較煩瑣。將原生質體與13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液頂部，形成一個界面。在后兩種方法中，最后都是在100g下離心5-10分鐘，會在蔗糖溶液頂部形成一條原生質體帶。用吸管將帶輕輕地吸出來。常見原生質體活力檢測的方法包括熒光素二乙酸（FDA）法、酚藏花紅法、臺盼藍染色法、熒光增白劑（CFW）法。用0.01%的酚藏花紅染色，染成紅色的為死細胞，無色的為活細胞。用0.01%的FDA染色，在熒光顯微鏡下，發出綠色熒光的為有活力細胞。此外，原生質活力檢測的方法還有通過完整細胞膜排斥Evans藍的染料法，胞質環流檢測法，隨滲透壓改變原生質的體積變化，還可以測

51、定用氧電極測呼吸和光合作用的代謝。三、實驗材料洋蔥的鱗莖四、藥劑及器材(一)藥劑配制(1). 酶解液1%(W/V) 纖維素酶，1% (W/V)果膠酶，0.7mol/L甘露醇；10mmol/L CaCl2.2H2O，0.7mmol/L KH2PO4，pH 56。 制得的酶液在55加熱10分鐘，以滅活蛋白酶和增加酶的溶解性。在室溫下讓酶液緩慢冷卻。（2）CPW13M(洗滌及懸浮液)CPW鹽成分為：          KH2PO4       

52、;       27.2mg/L                  KNO3                101.0mg/L        

53、;          CaCl2.2H2O       1480.0mg/L                  MgSO4.7H2O      246.0mg/L     

54、0;             KI                 0.16mg/L                  CuSO4.5H2O 

55、;     0.025mg/L  pH 5.8CPW13M:  CPW鹽+13%甘露醇(mannitol)（3）0.01%的酚藏花紅先用少許95%乙醇溶解，然后加水定容。（二）儀器及器材超凈工作臺，培養皿，離心管，載玻片，刀片，鑷子， 200目篩網，吸管五、實驗步驟（一）原生質體的分離1、將新鮮花瓣用蒸餾水洗干凈，用濾紙吸干表面水分。2、用尖頭鑷子剝去材料的下表皮或將其剪成小細條，加 5 ml 混合酶液（2%纖維素酶 + 2%果膠酶），28黑暗條件下酶解。3、在酶解50min和70min時，取酶解液置載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。

56、比較不同酶解時間觀察的結果有何異同。4、用200目篩網過濾酶解液，濾液經 500rpm離心5min，棄去上清液。5、用34ml CPW13M液洗滌并溶解沉淀，懸液經1000rpm離心5min，去上清。6、用1 mlCPW13M液重懸沉淀，鏡檢并血球計數板計數。放置冰浴待用。（二）原生質體的活力檢測用0.01%的酚藏花紅染色，染成紅色的為死細胞，無色的為活細胞。六、思考題（一）概念題1、原生質體（二）選擇填空題1、在用酶解法提取原生質體時，酶解液中CaCl2的作用是A、維持膜的穩定性 B、保持滲透壓 C、保持酶的活性 D、破壞細胞連接2、在用酶解法提取原生質體時，酶解液中甘露醇的作用是A、維持膜

57、的穩定性 B、保持滲透壓 C、保持酶的活性 D、破壞細胞連接3、下面那些方法可以檢測所提原生質體的活力A、觀察胞質環流 B、石炭酸品紅染色 C、臺盼藍染色 D、改變滲透壓（三）填空題1、原生質體的活力檢測時，用0.01%的酚藏花紅染色，染成紅色的為（ ）細胞，無色的為（ ）細胞。2、原生質體分離最基本的原則為（ ）。3、原生質體分離時，KH2PO4的主要作用是（ ），如果有（ ），最好用它來代替。4、在制備原生質體實驗中，配制的酶解液在55下加熱10分鐘，以滅活（ ）增加（ ）。（四）問答題1、分離原生質體的方法有哪些?各有什么優缺點？2、簡述原生質體純化的方法及原理。實驗九植物核仁組織區標本制作與觀察一、原理1976年Goodpasture等應用銀染色技術，使9種哺乳動物的核仁組織者區（NORs）特異性的染為黑色，該技術被稱為Ag-As的銀染技術，銀染色陽性的NORs被稱為Ag-NO