1、    地下芽孢桿菌zdc01抑菌效果及其防效研究    邱森森 胡修俊 朱鳳蒙 張德超摘要 對從東海海底土壤沉積物中分離獲得的菌株zdc-01的抑菌活性、抑菌機理、室內(nèi)防治效果進行了研究。結(jié)果表明，該菌株對8種病原菌具有顯著的抑菌作用，菌懸液較無菌濾液的抑制率更高，抑制率高達96.87%。通過噴霧處理刺傷接種發(fā)現(xiàn)，噴施zdc-01發(fā)酵液、菌懸液的防治效果隨時間的延長稍有降低，但仍與腐霉利處理相當，而無菌濾液的防治效果較差，7 d后僅為9.53%。關(guān)鍵詞 菌株zdc-01；抑菌活性；抑菌機理；防治效果s476+.19 a 1007-5739（2018）1

2、3-0097-02research on antibacterial effect and control efficiency of bacillus subterraneus zdc-01qiu sen-sen 1 hu xiu-jun 1 zhu feng-meng 1 zhang de-chao 2（1 qingdao zhongda agritech co.，ltd.，qingdao shandong 266109； 2 institute of oceanology，chinese academy of sciences）abstract the antimicrobial act

3、ivity，antimicrobial mechanism and control effect of strain zdc-01 isolated from the soil sediments of the seabed in the east china sea were studied.the results showed that the strain had significant inhibitory effect on 8 fungi，the inhibition rate of bacterial suspension was better than that of ster

4、ile filtrate，and the inhibition rate was 96.87%.by inoculation of spray-treated stab wound it was found that the control effects of fermentation broth and bacteria suspension decreased slightly with the prolongation of time，but were still equal to that of procymidone.the control effect of sterile fi

5、ltrate was only 9.53% after 7 days.key words strain zdc-01；antimicrobial activity；antimicrobial mechanism；control effect植物病害是影響植物健康、作物產(chǎn)量甚至生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的一個重要因素，更是作物生產(chǎn)中不可忽視的一大難題。據(jù)統(tǒng)計，每年因植物病害造成的減產(chǎn)損失為總產(chǎn)量的10%15%，其中70%80%是由病原真菌侵染所致1-2。植物真菌病害不僅直接造成農(nóng)作物產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低，而且部分病原真菌還分泌多種毒素，對農(nóng)產(chǎn)品安全造成極大的威脅。此外，目前植物真菌病害的防治以化學(xué)防治為主，但

6、化學(xué)藥劑易造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、抗藥性等一系列問題，甚至?xí)：θ诵蠼】怠Ｉ锓乐尉哂邪踩h(huán)保、持效期長等特點，其發(fā)展趨勢與食品安全、生態(tài)環(huán)境和生物多樣性有良好的相融性3。因此，尋找廣譜、高效的生物農(nóng)藥成為農(nóng)藥發(fā)展的新方向。隨著生物防治研究的不斷深入，從陸生資源中分離篩選出新的有效生防菌越來越難，探索新的生防資源迫在眉睫。海洋微生物因其遺傳和代謝的特殊性而具有產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)的巨大潛力4-7，目前已有關(guān)于海洋生防微生物的報道。邵彥坡等8發(fā)現(xiàn)了1株海洋放線菌b5對13種植物真菌病害有顯著的抑制作用，并對其發(fā)酵液進行了穩(wěn)定性測定；田 黎等9報道1株海洋芽孢桿菌b-9987的代謝產(chǎn)物不僅可以破壞

7、真菌病害的菌絲，還可促進植物生長；陳 香等10鑒定了1株海洋短小枯草芽孢桿菌，并對其生長條件和抑菌活性進行了研究。本研究從東海海底土壤沉積物（北緯31°00，東經(jīng)124°3）中分離篩選出1株具有抑菌活性的海洋細菌，在鑒定的基礎(chǔ)上對該菌株的抑菌活性、抑菌機理以及室內(nèi)防治效果進行了初步研究，以期為進一步研究該菌及其對植物病害的防治提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 供試菌株。菌株zdc-01，由中國科學(xué)院海洋研究所從東海海底土壤沉積物中分離獲得，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16s rdna序列分析，將其鑒定為地下芽孢桿菌bacillus subterraneus。供

8、試病原真菌有蘋果葉枯炭疽病菌（glomerella cingulate）、茄子灰霉病菌（botrytis cinerea）、白菜黑斑病菌（alternaria brassicae）、棉花枯萎病菌（fusarium oxysporum）、小麥赤霉病菌（fusarium graminearum）、柑橘炭疽病菌coll-etotrichum gloeosporioides（penz.）sacc、蘋果炭疽病菌（glom-erella cingulata）、蘋果輪紋病菌（botryosphaeria dothidea），由青島中達生物技術(shù)研究所生物實驗室提供。1.1.2 供試培養(yǎng)基。2216e培養(yǎng)基（酵

9、母提取物1 g，蛋白胨5 g，瓊脂粉20 g，過濾后的海水1 000 ml，ph調(diào)至7.47.5），用于海洋細菌菌株的活化與保存；lb培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 ml，ph調(diào)至7.07.2），用于菌株zdc-01的發(fā)酵培養(yǎng)和抑菌機理研究；pda培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 ml，ph調(diào)至7.07.2），用于植物病原真菌的活化與保存。1.1.3 供試藥劑。50%腐霉利可濕性粉劑，由日本住友化學(xué)株式會社生產(chǎn)。1.2 試驗方法1.2.1 菌株zdc-01抑菌活性測定。采用平板對峙培養(yǎng)法11

10、，在直徑90 mm的lb平板一側(cè)接種病原菌菌餅，在平板另一側(cè)劃線接種菌株zdc-01，兩者相距25 mm，以單獨接種病原菌的平板作對照。于25 恒溫暗培養(yǎng)，4 d后測量抑菌帶寬度，每處理設(shè)3次重復(fù)。1.2.2 菌株zdc-01抑菌機理。用接種環(huán)挑取菌株zdc-01的單菌落接種于lb液體培養(yǎng)基中，于30 、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，得到菌株zdc-01種子液。按2%的初始接種量接種于98 ml新鮮lb液體培養(yǎng)基中，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，即為zdc-01發(fā)酵液。將發(fā)酵液于7 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，經(jīng)細菌過濾器（孔徑0.22 m）過濾即得無菌濾液

11、。將發(fā)酵液在7 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，收集菌體，用無菌水洗滌菌體，并用其制成菌懸液。采用菌絲生長速率法12，將無菌濾液和菌懸液分別與融化冷卻的lb培養(yǎng)基（4550 ）混勻（稀釋50倍），倒平板，于平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，以單獨接種病原菌的平板作對照。于25 恒溫暗培養(yǎng)，待對照長滿3/4培養(yǎng)皿時，用十字交叉法測量對照組及處理組的菌落直徑，計算抑制率，每處理設(shè)3次重復(fù)。計算公式如下：抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×1001.2.3 菌株zdc-01對茄子灰霉病的防治效果。采用噴霧處理刺傷接種法1

12、3，選擇長度240300 mm的健康茄子，經(jīng)流水洗凈后用75%酒精表面消毒，晾干備用。在果實1/3、2/3處刺傷（傷口直徑約0.3 mm，深約1.0 mm），每個果實4處傷口。將上述處理液均勻噴霧到果實上直到有水滴滴下，在無菌操作臺上吹干后再次噴霧，直至每個果實接種15 ml處理液，于24 h后在刺傷處接種茄子灰霉病菌菌餅；對照組和農(nóng)藥處理組果實分別于噴霧15 ml無菌lb液體培養(yǎng)基和50%腐霉利可濕性粉劑2 500倍液后24 h在刺傷處接種茄子灰霉病菌菌餅。接種后果實置于25 、100%相對濕度下培養(yǎng)，定期觀察病斑擴展情況，測定病斑面積并計算防治效果。每個處理接種3個果實，設(shè)置3次重復(fù)。計算

13、公式如下：防治效果（%）=（對照組病斑面積-處理組病斑面積）/對照組病斑面積×1002 結(jié)果與分析2.1 菌株zdc-01抑菌活性測定通過對峙培養(yǎng)，對菌株zdc-01的抑菌活性進行了測定，結(jié)果見表1。可以看出，菌株zdc-01對蘋果葉枯炭疽病菌、茄子灰霉病菌、白菜黑斑病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、蘋果炭疽病菌、蘋果輪紋病菌8株病原菌均有不同程度的抑制作用，抑菌帶寬度在17.823.2 mm之間。其中，對茄子灰霉病菌的抑菌活性最高，其抑菌帶寬度為23.2 mm；其次是蘋果葉枯炭疽病菌和棉花枯萎病菌，抑菌帶寬度分別為22.7、21.8 mm；對柑橘炭疽病菌的抑菌作用最差

14、，抑菌帶寬度為17.8 mm。2.2 菌株zdc-01的抑菌機理由表2可知，菌株zdc-01無菌濾液、菌懸液對8種病原菌的抑制率存在顯著差異。菌懸液對8種病原菌的抑制率在88.35%96.87%之間，而無菌濾液對病原菌的抑制率在0.35%13.73%之間，無菌濾液處理的抑制率均顯著低于菌懸液處理的抑制率。菌懸液對茄子灰霉病菌的抑制率最高，達96.87%；其后是蘋果葉枯炭疽病菌和小麥赤霉病菌，抑制率分別為94.89%、94.53%；對柑橘炭疽病菌的抑制率最低，為88.35%。2.3 菌株zdc-01對茄子灰霉病的防治效果由圖1可知，菌株zdc-01發(fā)酵液、無菌濾液和菌懸液對茄子灰霉病均有一定的防

15、治效果，菌株zdc-01發(fā)酵液和菌懸液處理的防治效果與腐霉利處理的防治效果不存在顯著差異（p<0.05）；但無菌濾液的處理防效較差，7 d后防效僅為9.53%。噴施菌株zdc-01發(fā)酵液和菌懸液后，防治效果隨時間的延長有所降低，從接種3 d后的92.57%、93.12%下降至7 d后的90.37%、89.76%，但仍與腐霉利處理效果相當。3 討論本研究表明，地下芽孢桿菌bacillus subterraneus抗菌譜廣、拮抗活性高；在抑菌機理的試驗中發(fā)現(xiàn)，菌懸液主要起抑菌作用，抑菌率高達96.87%；室內(nèi)試驗中，噴施發(fā)酵液、菌懸液的防效與腐霉利處理無顯著差異，而無菌濾液的防效較差，推測在

16、抑菌過程中菌株活體起主導(dǎo)作用，而代謝產(chǎn)物的作用甚微。由于室內(nèi)與田間環(huán)境差異很大，對其能否應(yīng)用于生產(chǎn)實踐還需做進一步的田間試驗驗證。另外，其發(fā)酵條件、運輸及儲存方式等也需要深入研究。目前，報道的芽孢桿菌主要是從陸地土壤中篩選得到，很少來自海洋14-17。由于海洋環(huán)境的極特殊性，如高壓、高鹽、低營養(yǎng)、低溫、無光照等特點都決定了生活于其中的微生物具有不同于陸地微生物的特點，使其代謝方式具有特異性，而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能獨特的天然活性代謝產(chǎn)物，具有重要的開發(fā)價值。因此，利用海洋微生物尋找新的藥物資源成為研究熱點18。4 參考文獻1 康振生.我國植物真菌病害的研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略j.植物保護，2010，36（3

17、）：9-12.2 朱昌雄，蔣細良，姬軍紅，等.我國生物農(nóng)藥的研究進展及對未來發(fā)展建議j.現(xiàn)代化工，2003，23（7）：1-4.3 楊麗榮，全鑫，劉玉霞，等.農(nóng)用微生物殺菌劑研究進展j.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，38（9）：131-134.4 胡萍，王雪青.海洋微生物抗菌物質(zhì)的研究進展j.食品科學(xué)，2004，25（11）：397-401.5 劉全永，胡江春，薛德林，等.海洋微生物生物活性物質(zhì)研究j.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2002，13（7）：901-905.6 habbu p，warad v，shastri r，etal.antimicrobial metabolites from marine mic

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