1、1 郝圓園 201731830流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用應(yīng)用2流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。和分選的新技術(shù)。 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)3 流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)

2、對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。 特點(diǎn)：檢測(cè)速度快、檢測(cè)通量高、單細(xì)胞多參數(shù)的檢測(cè)特點(diǎn)：檢測(cè)速度快、檢測(cè)通量高、單細(xì)胞多參數(shù)的檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)4 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速測(cè)量并可分、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速測(cè)量并可分類(lèi)收集的高技術(shù)。類(lèi)收集的高技術(shù)。流式流式

3、細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀儀流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀5樣本來(lái)源：樣本來(lái)源：各種細(xì)胞（如外周血，骨髓，實(shí)體組織、懸浮或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞），微生物，人工合成微球等。檢測(cè)大小：檢測(cè)大小：一般是0.5um40um流式細(xì)胞儀可以做什么？流式細(xì)胞儀可以做什么？6液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 分析型流式細(xì)胞分析型流式細(xì)胞儀儀分選系統(tǒng)分選系統(tǒng)分選型流式細(xì)胞儀分選型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀的組成流式細(xì)胞儀的組成7（1）液流 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)流動(dòng)室流動(dòng)室流動(dòng)室（流動(dòng)室（Flow cellFlow cell）是液流系統(tǒng)的核心部件，流動(dòng)室是由石英玻璃制成，單細(xì)胞懸液在流動(dòng)室里被鞘液流包繞通過(guò)流動(dòng)室內(nèi)

4、一定孔徑的孔，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，細(xì)胞在此與激光垂直相交。8層流水力聚焦技術(shù)層流水力聚焦技術(shù)9光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)Light scattering at Light scattering at FSCFSC represents the particle size and represents the particle size and areaareaLight scattering at SSC Light scattering at SSC depends on granularity and depends on granularity and complexity of the part

5、iclecomplexity of the particle10 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光器 分色反光鏡：反射長(zhǎng)分色反光鏡：反射長(zhǎng)/ /短波長(zhǎng)，通過(guò)短短波長(zhǎng)，通過(guò)短/ /長(zhǎng)波長(zhǎng)長(zhǎng)波長(zhǎng) 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光 濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：FS, SSFS, SS（散射光），（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）（熒光）光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)11FlowFlowTipTipL

6、aserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光學(xué)系統(tǒng)示意圖光學(xué)系統(tǒng)示意圖12主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)13基本工作原理基本工作原理14單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動(dòng)室噴嘴熒光檢測(cè)系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號(hào)熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號(hào)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過(guò)程基本過(guò)程15 細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周?chē)蛑車(chē)?60立體角方向散射的光線立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形信號(hào)

7、，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為為前向散射光前向散射光和側(cè)向散射光側(cè)向散射光。二、散射光的測(cè)定二、散射光的測(cè)定1617前向散射光前向散射光（forward scatter, forward scatter, FSFS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度以相對(duì)軸較小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。18FALS SensorLaser前向散射光示意圖前向散射光示意圖19

8、側(cè)向散射光（side scatter, SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。20FALS Sensor90LS SensorLaser側(cè)向散射光側(cè)向散射光示意圖示意圖21 測(cè)得的測(cè)得的FSFS與與SSSS信信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到可得到FS-SSFS-SS圖，由此圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。分析或分選。 此為血細(xì)胞分類(lèi)此為血細(xì)胞分類(lèi)的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：光散射

9、測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群從非均一群體中鑒別出某些亞群 22熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征

10、。個(gè)不同特征。線性放大器和對(duì)數(shù)放大器線性放大器和對(duì)數(shù)放大器三、熒光測(cè)量三、熒光測(cè)量23熒光染料的特性熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)(EMISSION)2425熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償26 通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。四、細(xì)胞分選原理四、細(xì)胞分選原理27細(xì)胞懸液形成液流柱細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴液流斷裂成液滴空白液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴含細(xì)胞的液滴棄去棄去偏轉(zhuǎn)落入收集

11、器偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體壓電晶體產(chǎn)生產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)機(jī)械振動(dòng)不充電不充電充電充電（一）分選基本原理（一）分選基本原理28 分選速度：分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中單位時(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。細(xì)胞的含量成正比。 分選純度：分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分率。 分選收獲率：分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過(guò)測(cè)量點(diǎn)實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過(guò)測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。 分選得率：分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的

12、總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。分選速度成反比。（二）分選的技術(shù)要求（二）分選的技術(shù)要求29 參數(shù)：參數(shù)：FS,SS,FLFS,SS,FL 數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 （單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖 、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖 、二維、二維等高圖等高圖 、假三維等高圖、假三維等高圖 、三參數(shù)散點(diǎn)圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖 ） 設(shè)門(mén)分析技術(shù)設(shè)門(mén)分析技術(shù) 第二節(jié)第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析數(shù)據(jù)的顯示與分析30FSFS：反映顆粒的大小：反映顆粒的大小SSSS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FLFL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多

13、少：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、一、 參數(shù)參數(shù)31 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖: :點(diǎn)圖點(diǎn)圖 二維等高圖二維等高圖 假三維等高圖假三維等高圖 三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析多參數(shù)分析直分析方圖直分析方圖設(shè)門(mén)分析設(shè)門(mén)分析: :REGION和和GATE設(shè)置設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式二、數(shù)據(jù)顯示方式32 由一維參數(shù)由一維參數(shù)( (散射光或熒光散射光或熒光) )與顆粒計(jì)數(shù)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)(COUNT)構(gòu)成，反映同構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖（一）單參數(shù)直方圖33單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)

14、數(shù)量細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道信道(channel(channel ) )34 雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。 雙參數(shù)信號(hào)雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖（二）雙參數(shù)直方圖351.雙參數(shù)直方圖

15、點(diǎn)圖雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度36雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖372. 二維等高圖二維等高圖 由類(lèi)似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。由類(lèi)似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。 等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等等高高”。 曲線層次越高曲線層次越高( (越里面的線越里面的線) ) 所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。 等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。38二維等高圖二維等高圖393. 假三維等高圖假三維等高圖40（三

16、）三參數(shù)直方圖（三）三參數(shù)直方圖41 多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析42 Gate Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)

17、胞的分布情況。根據(jù)門(mén)的形狀又分為了線性門(mén)、矩形門(mén)、圓根據(jù)門(mén)的形狀又分為了線性門(mén)、矩形門(mén)、圓形門(mén)、多邊形門(mén)、任意形狀門(mén)和十字門(mén)。形門(mén)、多邊形門(mén)、任意形狀門(mén)和十字門(mén)。 三、設(shè)門(mén)分析技術(shù)三、設(shè)門(mén)分析技術(shù)43A A 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞B B 單核細(xì)胞單核細(xì)胞C C 中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞A A、B B、C C均均為任意門(mén)為任意門(mén)44線性門(mén)線性門(mén)45RegionRegion設(shè)置設(shè)置: : 區(qū)閾（區(qū)閾（region, Rregion, R）與門(mén)）與門(mén)(gate, G ) (gate, G ) 是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門(mén)對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門(mén)。可與門(mén)對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門(mén)。46D1

18、CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門(mén)分析時(shí)，起如十字門(mén)分析時(shí)，起就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即成，即G=D1+D2+D3+D4。 47第四節(jié)第四節(jié) 流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求 樣本制備樣本制備 標(biāo)記染色標(biāo)記染色 液相芯片技術(shù)液相芯片技術(shù) 質(zhì)量控制質(zhì)量控制 48外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備分離單個(gè)核細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備 蛋白酶消化蛋白酶消化 機(jī)械吹打機(jī)械吹打 使貼壁細(xì)胞脫落使貼壁細(xì)胞脫落 洗滌洗滌 尼龍網(wǎng)過(guò)濾尼龍網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸

19、液一、免疫檢測(cè)樣品制備一、免疫檢測(cè)樣品制備49新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備 機(jī)械法機(jī)械法 酶處理法酶處理法 化學(xué)試劑處理法化學(xué)試劑處理法 表面活性劑處理法表面活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存單細(xì)胞懸液的保存 深低溫保存法（一年）深低溫保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周） 甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）50適用條件適用條件: : 有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù) 對(duì)對(duì)488nm488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收 發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)

20、間有較大的波長(zhǎng)差 易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色51FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光細(xì)細(xì)胞胞懸懸液液異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素得州紅得州紅能量傳遞復(fù)合染料能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類(lèi)藻膽蛋白類(lèi)（一）幾種常見(jiàn)的熒光染料（一）幾種常見(jiàn)的熒光染料52名稱名稱染料染料激發(fā)激發(fā)波長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光顏熒光顏色色溶解性溶解性對(duì)對(duì)PHPH敏感敏感性性特點(diǎn)特點(diǎn)異硫氰酸熒異硫氰酸熒光素光素FITCFITC488488綠

21、綠 525525易易敏感敏感易溶于水，與抗體結(jié)易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性合不影響特異性得州紅得州紅Texas Texas redred568568紅紅 615615不易不易不敏感不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低額低藻紅蛋白藻紅蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488別藻青蛋白別藻青蛋白APCAPC633633紅紅670670能量傳遞復(fù)能量傳遞復(fù)合染料合染料PEcy5PEcy5488488紅紅670670易易不敏感不敏感減少交叉，成本高減少交叉，成本高常

22、用的幾類(lèi)熒光染料常用的幾類(lèi)熒光染料53 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm488nm激激發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料能量傳遞復(fù)合染料54PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷花青苷5 5藻紅蛋白藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制55熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式熒光染料與細(xì)胞成分的四

23、種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合嵌入結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法免疫熒光標(biāo)記方法直標(biāo)直標(biāo): :干擾少干擾少, ,但需購(gòu)買(mǎi)多種單抗但需購(gòu)買(mǎi)多種單抗間標(biāo)間標(biāo): :步驟多步驟多, ,干擾多干擾多, ,不需標(biāo)記多種抗體不需標(biāo)記多種抗體組合標(biāo)記組合標(biāo)記（二）免疫熒光標(biāo)記（二）免疫熒光標(biāo)記56免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)是把微小的是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對(duì)乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對(duì)不同檢測(cè)物的乳膠微球混合后再加入待標(biāo)本，在不同檢測(cè)物的乳膠微球混合后再加入待標(biāo)本，在懸液

24、中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后懸液中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測(cè)特產(chǎn)生不同顏色，并可進(jìn)行定量分析。不同待測(cè)特產(chǎn)生不同顏色，并可進(jìn)行定量分析。因檢測(cè)速度極快，所以又有因檢測(cè)速度極快，所以又有“液相芯片液相芯片”之稱之稱 。三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用57微小的乳膠微球分別染成上百微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來(lái)編碼）片則是用顏色來(lái)編碼）5859通過(guò)對(duì)標(biāo)記不同熒光素分子的檢測(cè)，實(shí)通過(guò)對(duì)標(biāo)記

25、不同熒光素分子的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)FCMFCM對(duì)可溶性物質(zhì)的定量分析對(duì)可溶性物質(zhì)的定量分析60四、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制四、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制 適當(dāng)?shù)闹苽浞绞竭m當(dāng)?shù)闹苽浞绞?處理紅細(xì)胞處理紅細(xì)胞 實(shí)體組織來(lái)源標(biāo)本用機(jī)械法實(shí)體組織來(lái)源標(biāo)本用機(jī)械法 溫度溫度2525 3737，pH7.0pH7.0 7.27.2（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控61 溫度溫度 pHpH 染料濃度染料濃度 固定劑固定劑（二）免疫熒光染色的質(zhì)控（二）免疫熒光染色的質(zhì)控62 光路與流路校正光路與流路校正: : 確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（變

26、異（CVCV）。）。 PMTPMT（光電倍增管）校準(zhǔn)（光電倍增管）校準(zhǔn): : 保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳靈敏保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。度工作狀態(tài)。 絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn)絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn): : 保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。（三）儀器操作的質(zhì)控（三）儀器操作的質(zhì)控63 同型對(duì)照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照，選用相同源性的同型對(duì)照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照，選用相同源性的未標(biāo)記單未標(biāo)記單抗抗作為對(duì)照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。作為對(duì)照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。 全程質(zhì)量控制：與待測(cè)標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測(cè)，結(jié)果達(dá)靶值，提示本次全程質(zhì)量控制：與待測(cè)標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測(cè)，結(jié)果達(dá)靶值，提示本次

27、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。（四）免疫檢測(cè)的質(zhì)控（四）免疫檢測(cè)的質(zhì)控64第四節(jié)第四節(jié) 在免疫學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用 流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用各方面，用流式基礎(chǔ)研究和逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用各方面，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面的抗原成分進(jìn)行標(biāo)記分析，細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面的抗原成分進(jìn)行標(biāo)記分析，可區(qū)別多種細(xì)胞的特性，為細(xì)胞免疫的研究增可區(qū)別多種細(xì)胞的特性，為細(xì)胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。加了有效的手段和幫助。 65T T淋巴細(xì)胞及其亞群分析淋巴細(xì)胞及其亞群分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD

28、8+T)Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B B淋巴細(xì)胞及其亞群分析淋巴細(xì)胞及其亞群分析B1(CD19+CD5+):B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生產(chǎn)生IgMIgM型自身抗體型自身抗體, , 參與免疫調(diào)節(jié)、與自身參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)免疫病的發(fā)生有關(guān)B2(CD19+CD5-):B2(CD19+CD5-):受外來(lái)抗原刺激受外來(lái)抗原刺激, , 產(chǎn)生高親和性特異性抗體產(chǎn)生高親和性特異性抗體NKNK細(xì)胞分析細(xì)胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析66二、淋巴細(xì)

29、胞功能分析二、淋巴細(xì)胞功能分析 細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)( (死細(xì)胞與活細(xì)胞比例死細(xì)胞與活細(xì)胞比例) ) 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對(duì)淋巴瘤和白血病進(jìn)行多色免疫分型對(duì)淋巴瘤和白血病進(jìn)行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預(yù)后及檢出微小用于選擇化療方案、判斷預(yù)后及檢出微小殘留病變殘留病變67CD4+Th細(xì)胞、細(xì)胞、CD4+/CD8+比例比例MDR(+)表示對(duì)化療藥物耐藥表示對(duì)化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析四、腫瘤耐藥基因分析五、五、AIDS病檢測(cè)中的應(yīng)用病檢測(cè)中的應(yīng)用68HLA-B27可出現(xiàn)在可出現(xiàn)在58%97%的強(qiáng)直的強(qiáng)直性脊椎炎性脊椎炎(As) 患者患者六、自身免疫病相關(guān)六、自身免疫病相關(guān)HLAHLA抗原分析抗原分析69七、移植免疫中的應(yīng)用七、移植免疫中的應(yīng)用 FCMFCM作為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，已應(yīng)用于多個(gè)作為一個(gè)強(qiáng)