1、實驗七實驗七 大腸菌群的測定大腸菌群的測定一一 實驗目的實驗目的n1、掌握大腸桿菌的鑒定和計數、掌握大腸桿菌的鑒定和計數方法方法n2、 鞏固無菌操作技術鞏固無菌操作技術二二 大腸桿菌鑒定原理大腸桿菌鑒定原理n大腸菌群：一群能發酵乳糖、產酸產氣、需大腸菌群：一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中有否染腸道致病菌的可能。有否染腸道致病菌的可能。n 樣品中大腸菌群系以樣品中大腸菌群系以

2、100mL100mL（g g）檢樣內大）檢樣內大腸菌群最大可能數（腸菌群最大可能數（MPN)MPN)表示。表示。 細細 菌菌 學學 檢檢 驗驗 程程 序序 樣品樣品 細菌總數細菌總數 大腸菌群大腸菌群 水樣稀釋或不稀釋水樣稀釋或不稀釋 水樣稀釋或不稀釋水樣稀釋或不稀釋 第一步第一步- 初步發酵試驗初步發酵試驗 傾注平板培養傾注平板培養 （乳糖發酵）（乳糖發酵） 37 24小時小時 37 24小時小時 菌落計數菌落計數 第二步第二步- 平板分離培養平板分離培養（取平均數報告）（取平均數報告） （轉種鑒別培養基）（轉種鑒別培養基） 37 24小時小時 革蘭染色鏡檢革蘭染色鏡檢 第三步第三步- 乳糖

3、復發酵試驗乳糖復發酵試驗 報告結果報告結果 三、實驗器材三、實驗器材 1 1、恒溫培養箱（、恒溫培養箱（36361 1 ）、高壓滅菌）、高壓滅菌鍋鍋 、天平、滅菌培養皿、試管。、天平、滅菌培養皿、試管。 2 2、培養基及試劑：、培養基及試劑：n 乳糖膽鹽發酵管、伊紅美藍瓊脂平板乳糖膽鹽發酵管、伊紅美藍瓊脂平板（EMBEMB）四、實驗步驟四、實驗步驟大腸菌群的檢測大腸菌群的檢測 檢品檢品 膽鹽乳糖發酵管膽鹽乳糖發酵管 伊紅美蘭平板伊紅美蘭平板 大腸桿菌菌落純培養大腸桿菌菌落純培養 乳糖復發酵管（乳糖復發酵管（-） 乳糖復發酵管（乳糖復發酵管（） n1、檢樣稀釋、檢樣稀釋n以無菌操作將檢樣以無菌操

4、作將檢樣1mL1mL放于含有放于含有9mL9mL滅菌生理鹽水或滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內，經充分振搖或研磨做成其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內，經充分振搖或研磨做成1 1：1010的均勻稀釋液。的均勻稀釋液。n用用1ml1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1 1：1010稀釋液稀釋液1mL1mL，注入含有，注入含有9mL9mL生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混勻，做生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混勻，做成成1 1：100100的稀釋液。的稀釋液。n另取另取1ml1ml滅菌吸管，按上述操作依次作滅菌吸管，按上述操作依次作1010倍遞增稀倍遞增稀釋液。釋液。n根據食品衛生要求或對檢驗樣

5、品污染情況估計，選根據食品衛生要求或對檢驗樣品污染情況估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度，接種擇三個稀釋度，每個稀釋度，接種3 3管，每支試管接管，每支試管接種種1ml1ml。n2. 乳糖發酵試驗乳糖發酵試驗n 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發酵管內，接種量在將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發酵管內，接種量在1mL1mL以上者，用以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管雙料乳糖膽鹽發酵管；1mL1mL及及1mL1mL以以下者，用下者，用單料乳糖發酵管單料乳糖發酵管。每一個稀釋度接種。每一個稀釋度接種3 3管，管，置置363611溫箱內，培養溫箱內，培養24h24h2h2h，如所有乳糖，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報

6、告為大腸菌群陰性，膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產生者，則按下列程續進行。如有產生者，則按下列程續進行。3.3.分離培養分離培養n 將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置363611溫箱內，培養溫箱內，培養18h18h24h24h，然后取出，觀察菌，然后取出，觀察菌落形態并做革蘭氏染色和證實試驗。落形態并做革蘭氏染色和證實試驗。4.4.證實試驗證實試驗n在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1 12 2個進行革蘭個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，置氏染色，同時接種乳糖發酵管，置363611

7、的溫箱內的溫箱內培養培養24h24h2h2h，觀察產氣情況。，觀察產氣情況。n凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，即報告凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，即報告為大腸菌群陽性。為大腸菌群陽性。5.5.報告報告n根據證實為大腸菌群陽性的管數，查根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPNMPN檢索表，報告檢索表，報告每每100mL100mL（g g）食品中大腸菌群的）食品中大腸菌群的MPNMPN 值。表1 大腸菌群最可能數（MPN）檢索表 陽性管數 MPN 100mL(g） 95%可信限 1mL(g)3 0.1mL(g) 3 0.01mL(g) 3 下限 上限 0 0 0 0 0 0 0

8、 0 0 1 2 3 30 30 60 90 5 90 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 2 3 30 60 90 120 5 130 0 0 0 0 2 2 2 2 0 1 2 3 60 90 120 160 0 0 0 0 3 3 3 3 0 1 2 3 90 130 160 190 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 2 3 40 70 110 150 5 10 200 210 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 70 110 150 190 10 30 230 360 1 1 1 1 2 2 2 2 0 1 2 3 110 150 200 240 30 360 1

9、 1 1 1 3 3 3 3 0 1 2 3 160 200 240 290 2 2 2 200000123901402002601030360370 2 2 2 2111101231502002703403070440890 2 2 2 222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003

10、503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000大腸菌群測定大腸菌群測定 挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無光澤菌落；挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無光澤菌落； 紅色、粉紅色菌落。紅色、粉紅色菌落。抑制劑：膽鹽、煌綠、十二烷基硫酸鈉。抑制劑：膽鹽、煌綠、十二烷基硫酸鈉。 產酸判斷：紫色培養液變成黃色產酸判斷：紫色培養液變成黃色產氣判斷：發酵導管內有小氣泡，如輕輕打動試產氣判斷：發酵導管內有小氣泡，如輕輕打動試管有氣泡沿管壁上浮，應考慮可能有氣體產生，管有氣泡沿管壁上浮，應考慮可能有氣體產生，需進一步試驗。需

11、進一步試驗。 飲用飲用水、乳、冷飲食品衛生標準的細菌指標水、乳、冷飲食品衛生標準的細菌指標 指指 標標 細菌總數細菌總數 大腸菌群大腸菌群 飲用飲用水水 100個個/ml 3個個/L 消毒牛奶消毒牛奶 30，000個個/ml 40個個/100ml 瓶裝汽水、果味水瓶裝汽水、果味水 及果汁類飲料及果汁類飲料 品品 種種 100個個/ml 5個個/100ml五、實驗報告五、實驗報告（一）、列表記錄并計算實驗結果（一）、列表記錄并計算實驗結果（二）、思考題（二）、思考題1 1、怎樣判斷分離到的微生物是大腸桿菌？、怎樣判斷分離到的微生物是大腸桿菌？2 2、接種了微生物的培養皿為什么要倒置、接種了微生物的培養皿為什么要倒置培養？培養？實驗準備（實驗準備（2個樣品個樣品/組）組）n培養皿培養皿：1010套套/ /組組n無菌水：無菌水：1