1、elisa測抗原實驗報告范文 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱elisa）是在免疫酶技術（immunoenzymatic techniques）的根底上開展起來的一種新型的免疫測定技術,elisa過程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原）, 再加相應酶標記抗體（抗原）,生成抗原（抗體）待測抗體（抗原）酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反響生成有色產物。借助分光光度計的光吸收計算抗體（抗原）的量。待測抗體（抗原）的定量與有色產生成正比。 用于免疫酶技術的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，

2、碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于elisa法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化復原反響，在呈色后須立刻測定，否那么空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準確地定量。 辣根過氧化物酶（hrp）是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素（protonhemin）區作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的最大吸收峰是403nm，hrp酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是（hrp的a（1cm 403nm 1%）25，式中1指hrp百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg

3、/ml 計算是hrp的a（1cm 403nm mg/ml=2.5）hrp純度（rz）=a403nm/a275nm純度rz（einheit zahl）值越大說明酶內所含雜質越少。高純度hrp的rz值在3.0左右，最高可達3.4。用于elisa檢測的hrp的rz值要求在3.0以上。 elisa的根本原理有三條： （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體外表，可能是蛋白和聚苯乙烯外表間的疏水性局部相互吸附，并保持其免疫學活性； （2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性； （3）酶結合物與相應抗原或抗體結合后，可根據參加底物的顏色反響來判定是否有免疫

4、反響的存在，而且顏色反響的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。 elisa法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為elisa法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此elisa法在生物醫學各領域的應用

5、范圍日益擴大，可概括四個方面： 1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現微量的免疫沉淀反響。 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。 根本方法一 用于檢測抗原的雙抗體夾心法: 1. 包被：用0.05m ph9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為110gml。在每個聚苯乙烯板的反響孔中加0.1ml，4過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。 2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反響孔中，置37孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。 3. 加酶標抗體：于各反響孔中，參加新鮮稀釋的

6、酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37孵育0.51小時，洗滌。 4. 加底物液顯色：于各反響孔中參加臨時配制的tmb底物溶液0.1ml，371030分鐘。 5. 終止反響：于各反響孔中參加2m硫酸0.05ml。 6. 結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反響孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反響為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測o·d值：在elisa檢測儀上，于450nm（假設以abts顯色，那么410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔o·d值，假設大于規定的陰性對照od值的2.1倍，即為陽性。 根本方法二 用于檢測抗體的間接法：

7、 用包被緩沖液將抗原稀釋至110gml， 每孔加0.1ml，4過夜。次日洗滌3次。 加一定稀釋的待檢樣品（抗體）0.1ml于上述已包被之反響孔中,置37孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照） 于反響孔中，參加新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用ddw洗滌。 其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。 （二） 酶與底物 酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯劑作用下聯結的產物。是elisa成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反響，還具有酶促反響，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。 免疫技術常用的酶及其底物 * 終止劑

8、為2mol/l h2so4 * 終止劑為2 mol/l檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑。 可催化以下反響： hrp+h2o2復合物 復合物+ah2過氧化物酶+h2o+a ah2 為無色底物, 供氫體； a 為有色產物。 （三） elisa常用的四種方法 1直接法測定抗原 將抗原吸附在載體外表； 加酶標抗體，形成抗原抗體復合物； 加底物。底物的降解量抗原量。 2間接法測定抗體 將抗原吸附于固相載體外表； 加抗體, 形成抗原-抗體復合物； 加酶標抗體； 加底物。 測定底物的降解量抗體量。 3雙抗體夾心法測定抗原 將抗原免疫第一種動物獲得的抗體吸附于固相外表;加抗原，形成抗原-抗體復合物; 加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復合物;加酶標抗