1、Id1啟動子的熒光素酶報告基因載體的構建及其在肝癌HepG2細胞中的活性檢測(1) 丁睿，韓霜，雷婷，劉杰，竇科峰 【摘要】 目的：擴增Id1啟動子基因，構建Id1啟動子的報告基因載體. 方法：通過PCR及雙酶切方法，從HepG2細胞基因組DNA中獲得Id1基因編碼序列上游包含不同長度堿基的兩段Id1啟動子序列；分別克隆到報告基因pGL3 enhancer載體上，構建包含兩段不同長度Id1啟動子的報告基因載體；用脂質體轉染法將兩報告基因載體分別轉染至肝癌HepG2細胞系；采用雙熒光素酶報告基因系統評估Id1啟動子活性. 結果：經PCR方法擴增出大小分別為1096 bp和266 bp的兩段不同長

2、度的Id1啟動子片段，序列測定其編碼序列及讀框正確，酶切鑒定亞克隆序列正確. 瞬時轉染HepG2后經報告基因檢測，兩段啟動子均具有轉錄活性. 結論：成功構建了Id1啟動子的報告基因載體，為進一步研究Id1啟動子和肝癌的關系奠定了實驗基礎. 【關鍵詞】 分化抑制因子 0引言 Id蛋白即分化抑制或DNA結合抑制蛋白是缺少DNA結合HLH轉錄因子的顯性負性 調節分子. 已知哺乳動物Id蛋白家族有Id1Id4等4位成 員. 它們可調節多種細胞進程，包括細胞生長、衰老、分化、凋亡和血管生成等1. 研究2表明Id蛋白特別是Id1，可通過滅活腫瘤抑制因子和激活生長促進通路而促進哺乳動物細胞的增殖和細胞周期的

3、進行，其可能是腫瘤增殖所必需的關鍵因子. Id1可能是預測慢性肝炎肝硬化患者的肝癌發生風險的有用指標， 并且可作為治療肝癌的靶向分子. 我們擬構建兩段包含不同長度Id1啟動子片段的報告基因載體， 轉染HepG2細胞后檢測兩段Id1啟動子的活性. 1材料和方法 材料pGL3enhancer 載體，內參照pRLTK載體和 luciferase reporter Kit；DualLipofectaminTM Reagent 和T4 DNA連接酶；細胞基因組DNA提取試劑盒；高保真Taq DNA聚合酶；Plasmid Miniprep Kit和Gel Extration Kit；DNA marker:

4、 GeneRulerTM 100 bp DNA ladder Plus和GeneRulerTM 1 Kb DNA ladder； 胰蛋白胨及酵母提取物； 限制性內切酶Hind，Kpn； 其余試劑均為國產分析純. TD20/20熒光照度計； HepG2細胞和 JM109菌株均為本實驗室保存. 方法 啟動子報告基因載體的構建 引物設計自XX網站數據庫檢索獲得Id1啟動子序列的-3000 100部分序列，分別設計兩段啟動子引物序列，并 在上游引物5端加入Kpn的酶切位點GGTACC，在下游引物5端加入Hind的酶切位點AAGCTT. 從轉錄起始零點開始， 兩段啟動子片段長度分別為:101976和18

5、976. 上游引物分別為Fw1：gggtaccgggagcacgggaactagc和Fw2：gggtaccccacccttgctgttctga；下游引物 Rv：aagcttggagaatgggcaaagcgaaa. 細胞培養及模板提取將HepG2細胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養基在37，50 mL/L CO2的孵箱中培養. 收集對數生長期細胞約1×107，以細胞基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA. 啟動子基因的克隆以HepG2細胞基因組DNA為模板，用Fw1為上游引物、Rv為下游引物，經預實驗選擇94變性1 min，55退火1 min，72延伸1 min,

6、 共30個循環，獲得一長度為1096 bp的片段，命名為Id1p1；選用Fw2為上游引物、Rv為下游引物，經預實驗選擇94變性30 s，54退火30 s，72延伸45 s, 共30個循環，獲得一長度為266 bp的片段，命名為Id1p2. 用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳獲得2條鑒定條帶，大小分別約為1100 bp和260 bp. 參照試劑盒的操作說明回收并純化. 啟動子載體的構建與測序將熒光素酶報告基因pGL3 enhancer載體分別行Kpn和Hind雙酶切，回收. 同時將之前回收的PCR產物同樣經Kpn和Hind雙酶切及瓊脂糖 凝膠電泳，分別回收約1100 bp和260 bp條帶. 使之

7、分別在T4連接酶的作下與pGL3enhancer載體以31和10 1的濃度比于16連接12 h，使Id1p1和Id1p2基因序列插入無啟動子的pGL3enhancer載體中. 以低溫CaCl2法轉 化感受態細菌，涂布于含氨芐青霉素的固體LB培養皿上，12 h后挑取單克隆菌落，以質粒小量提取試劑盒提取質粒. 行Kpn和Hind雙酶切并測序鑒定陽性克隆的重組質粒. 最終構建成重組報告基因載體Id1p1/PGL3和Id1p2/PGL3. 啟動子載體轉染肝癌HepG2細胞系將兩種重組質粒、空載體pGL3enhancer和內參照pRLTK載體轉化的陽性 菌株，在LB培養基中37搖床培養過夜，按質粒提取說

8、明分別提取Id1p1/pGL3，Id1p2/pGL3、空載體pGL3enhancer TK的DNA，經紫外分光光度儀測定A260 nm值. pRL和按 照LipofectaminTM Reagent脂質體轉染系統說明，于轉染前1日將細胞接種于24空板，5×104/孔，第2日當細胞約90%融合時，每孔分別定量加入Id1p1/pGL3 g，PRLTK 內參照載體100 ng，LipofectaminTM 5 L和無血清培養基200 L. 6 h后換含FBS 100 mL/L的RPMI 1640，培養18 h. 報告基因活性的檢測瞬時轉染24 h后收集、裂解細胞，離心取上清，用Dual L

9、uciferase Reporter Assay System 在TD20/20熒光照度計上測定裂解上清內Luc 活性, 計算 Firefly Luc / Renilla Luc的比值，并以空載體pGL3 enhancer轉染細胞作對照，進行比較以判斷Id1p1和Id1p2 啟動子活性. 2結果 目的基因的克隆及測序以肝癌細胞HepG2基因組DNA為模板，分別克隆出兩段Id1啟動子，分別為1096 bp的Id1p1和266 bp的Id1p2. 圖1PCR產物瓊脂糖凝膠電泳 略 啟動子報告基因載體酶切及測序鑒定回收經Kpn和Hind雙酶切得到的Id1p1和Id1p2兩重組質粒和pGL3 enha

10、ncer載體的相應條帶，經T4連接酶連接后轉化感受態細菌. 再經Kpn和Hind酶切后，兩種重組質粒分別釋放出1096 bp和266 bp大小的片段. 測序結果亦證實兩段均包含Id1啟動子序列. 表明包含不同長短的Id1啟動子報告基因載體構建成功. 圖2雙酶切重組質粒瓊脂糖電泳 略 轉錄活性的檢測兩段Luc報道基因載體轉染細胞均表現有Id1啟動子活性，空載體pGL3enhancer對照為，Id1p1 為，Id1p2為，二啟動子活性分別較對照升高倍和倍. 對結果分析表明，兩段均包含核心啟動子部分. 而Id1p1顯示更高的啟動子活性. 3討論 HLH轉錄因子具有調節細胞生長分化的重要作用，大多數H

11、LH蛋白屬于堿性的bHLH家族，具有高度保守的HLH結構域和堿性DNA結合區. Id蛋白是堿性DNA結合區缺失的bHLH蛋白，它與bHLH形成異源二聚體后即喪失結合DNA的能力，從而抑制了下游含有Ebox DNA片段的基因的轉錄， 因而在功能上Id是這類轉錄因子的顯性負性調節蛋白. 能與Id蛋白結合的分子可以分為兩大類，包括組織普遍表達的E47和組織特異性表達的MyoD. Id與后一類分子結合能力遠遠強于前者，但目前發現的這類分子屈指可數. 研究表明，轉染外源性Id1的鼻咽癌細胞、前列腺癌細胞和卵巢癌細胞的增殖率和S期細胞所占比例升高3. 異常表達Id1的前列腺癌細胞中p16INK4a水平降低

12、，CDK和磷酸化RB蛋白水平升高，提示Id1可能通過p16INK4a/pRB途徑促進腫瘤細胞增殖4. 另一實驗則表明Id1也可能通過激活MAPK途徑誘導腫瘤細胞增殖5. Id1的異常過表達還可誘導乳腺癌細胞持續增殖，當下調Id1表達時可導致細胞周期素cyclinD1和cyclinE的表達下降和cyclinE Cdk2活性降低，以及pRB的Ser780位點的磷酸化程度降低，這與下調cmyc蛋白表達的作用效果類似，提示Id1也可 myc蛋白表達依賴途徑從而促進細胞能參與cyclinD對c 周期進程，誘導腫瘤細胞增殖6. 而當阻斷Id1，Id2和 Id3蛋白表達時，人結腸腺癌S期細胞比率降低，且與阻

13、斷量負相關7. 此外，研究發現，Id1和Id2在高度侵襲性前列腺癌細胞PC3中高表達，而在非侵襲性的LNCaP細胞中低表達，且阻斷Id2表達后，可使腫瘤細胞侵襲和增殖能力降低8. 在上皮性卵巢腫瘤中，Id1的表達程度與腫瘤低分化和高侵襲特性相關，高表達的Id1可提示不良預后相關9. 以上均提示Id蛋白與腫瘤增殖、侵襲和轉移能力密切相關. 目前Id蛋白與肝癌相關性的研究仍鮮有報道. 初步發現高表達的Id1可能是預測慢性肝炎肝硬化患者的肝癌發生風險有價值的指標10. 通過組織微陣列研究表明Id1的表達與VEGF表達顯著相關，它可通過穩定化處理HIF1 alpha蛋白而介導VEGF的轉錄活性. 下調VEGF可抑制Id1從而延緩腫瘤細胞侵襲11. 我們成功構建了Id1兩段不同長度的啟動子載體并順利轉染肝癌HepG2細胞系，使受控于Id1啟動子的Luc報道基因在HepG2細胞中得到瞬時表達.