1、 20世紀90年代以來，對于植物細胞及其代謝產物的研究進入了新的發展時期，并出現了很多新技術和新方法，比如誘導子、前體飼養、兩相培養法、質體轉化、毛狀根和冠癭瘤組織培養等，顯示了植物細胞培養工程制藥的廣闊發展前景。第七節 進展與展望一、誘導子在植物細胞工程研究中的應用 利用誘導子進行有目的的次生代謝產物調控及生物合成，成為大幅度提高培養物中代謝產物含量的重要方法之一。 誘導子（elicitor），是植物抗病生理過程中誘發植物產生植物抗毒素和引起植物過敏反應（hypersensitive reaction, hr, 亦稱抗性反應或自身防御反應）的因子，包括侵染植物的微生物及植物細胞內的分子。 誘

2、導子在植物與微生物的相互作用中，能快速、高度專一性地誘導特定基因的表達。 誘導子可作為研究植物次生代謝信號識別及其細胞內信息傳遞的良好實驗體系。懸浮培養的西洋參細胞經刺盤孢菌絲狀誘導子處理后，懸浮培養的西洋參細胞經刺盤孢菌絲狀誘導子處理后，總皂甙產率由對照的總皂甙產率由對照的296mg/l296mg/l增長到了增長到了679mg/l679mg/l，并且，并且有有85%85%排放到了培養基中。排放到了培養基中。將果膠酶（將果膠酶（0.2%0.2%）添加到青蒿素合成培養基中，處理黃）添加到青蒿素合成培養基中，處理黃花蒿培養細胞花蒿培養細胞2 2天，青蒿素合成量比未加刺激的細胞提天，青蒿素合成量比未

3、加刺激的細胞提高了高了3.083.08倍。倍。真菌寡聚糖誘導子作為信號分子在南方紅豆杉細胞懸浮真菌寡聚糖誘導子作為信號分子在南方紅豆杉細胞懸浮培養體系中培養體系中 培養基中添加適量、適濃度培養基中添加適量、適濃度cuclcucl2 2能夠誘導紫杉醇的合能夠誘導紫杉醇的合成，成，0.5-30vmol/l0.5-30vmol/l范圍內，紫杉醇范圍內，紫杉醇 含量隨含量隨cuclcucl2 2濃度增加濃度增加而增加，而低于而增加，而低于0.5vmol/l0.5vmol/l時紫杉醇合成為零時紫杉醇合成為零1.誘導子的分類（1）定義 植物抗毒素是指在植物防御系統內能對抗微生物進攻的某些次級代謝產物，根據

4、其功能又可稱為后感染防御物質。 觸發形成植物抗毒素信號的物質稱為誘導子，能夠誘導植物細胞中的一個或幾個反應，并能形成特征性自身防御反應的分子。 誘導子可分為內源性誘導子和外源性誘導子（根據細胞內或外形成），或分為生物誘導子和非生物誘導子。 生物誘導子是指植物在防御過程中為對抗微生物感染而產生的物質。 所有不是植物細胞中天然成分但又能觸發形植物抗毒素信號的因子稱為非生物誘導子。（2）內源性誘導子 內源性誘導子主要指來自植物細胞的分子，多為植物細胞壁在微生物作用下的降解產物（如復雜多糖、糖蛋白）及沉積在細胞壁上的木質素。 多糖類又分為纖維素、半纖維素及果膠類。（3）外源性誘導子外源性誘導子亦稱真誘

5、導子（genuine elicitor），是指病源微生物在入侵植物時自身被降解的產物及其代謝產物。目前應用最多的是真菌誘導子，根據其結構可分為4類。 多糖類脫乙酰幾丁質是真菌細胞壁被幾丁質酶酶解是真菌細胞壁被幾丁質酶酶解的產物，是廣泛使用的多糖類誘導子，的產物，是廣泛使用的多糖類誘導子，它可誘導植保素的產生。木質素類及蛋白酶抑制劑，如大如大雄疫霉（雄疫霉（phytophthora megaspermaphytophthora megasperma）是由大雄）是由大雄疫霉細胞壁分離得到的多糖類誘導子，也是最常疫霉細胞壁分離得到的多糖類誘導子，也是最常用的誘導子之一。用的誘導子之一。 糖蛋白類作為

6、微生物細胞壁組成成分之一的糖蛋白類，可誘導引發防御反應。如在如在lucenelucene懸浮培養細胞中懸浮培養細胞中加入來源于植物病原性真菌的加入來源于植物病原性真菌的和和-糖蛋白可產生糖蛋白可產生具抗菌作用的次生代謝產物。具抗菌作用的次生代謝產物。 蛋白質類包括一些酶類及具蛋白性質的物質如綠色木霉如綠色木霉中的纖維素酶作為誘導子在中的纖維素酶作為誘導子在grapninegrapnine（真誘導子）（真誘導子）的懸浮培養中可引起的懸浮培養中可引起hrhr反應，另一來源于隱地疫霉反應，另一來源于隱地疫霉的具有蛋白質性質的誘導子亦能誘導的具有蛋白質性質的誘導子亦能誘導hrhr反應并大量反應并大量積

7、累植保素積累植保素cryptogeioncryptogeion。 不飽和脂肪酸類不飽和脂肪酸類作為一種誘導抗性反應的誘導子，對其研究不是很充分，但已發現多聚不飽和脂但已發現多聚不飽和脂肪酸（花生四烯酸）及其部分酯類可誘導馬鈴薯植肪酸（花生四烯酸）及其部分酯類可誘導馬鈴薯植保素保素risnitinrisnitin和和lubiminlubimin的產生。的產生。2.誘導子的作用機制 誘導子在植物中的具體作用機制尚未形成一套詳盡的理論體系。 非生物誘導子（外部培養條件）協同誘導可增加特征酶群活性。 生物誘導子除引起植物在其局部浸染部位做出迅速的過敏反應外，還誘導植物產生植保素，使植物得以免遭病原微生

8、物的侵染和破壞。在此激活過程中，誘導子與細胞膜上受體的結合，改變了膜離子通道，促使誘導過程迅速完成。 不同的誘導子可通過植物表面的不同部位而起作用，也是激活反應中有關基因的表現。3.誘導子在組織和細胞培養及其次生代謝產物生合成研究中的應用 將誘導子應用于植物細胞培養中以提高目的產物產量，這些誘導子包括：（1）糖蛋白類誘導子：如在培養基中加入糖基如在培養基中加入糖基化的氧化牛血清白蛋白（化的氧化牛血清白蛋白（bsabsa）和氧化溶菌酶可使）和氧化溶菌酶可使煙草葉產生抗原性尼克堿次生代謝產物的產量增煙草葉產生抗原性尼克堿次生代謝產物的產量增加加1010倍。倍。（2）蛋白質類誘導子：使用果膠酶及鏈狀

9、蛋白使用果膠酶及鏈狀蛋白酶作為誘導子來調節煙草細胞培養中酪胺代途徑酶作為誘導子來調節煙草細胞培養中酪胺代途徑中某些的酶的活性。中某些的酶的活性。（3）多糖類誘導子：v用不同的誘導子，如鐮刀霉菌絲體、乙烯、水楊酸、用不同的誘導子，如鐮刀霉菌絲體、乙烯、水楊酸、幾丁質和脫乙酰幾丁質及其低聚糖，分別作用于多幾丁質和脫乙酰幾丁質及其低聚糖，分別作用于多種模型植物上，結果表明用植物病原體鐮刀酶感染種模型植物上，結果表明用植物病原體鐮刀酶感染植株可誘導產生幾丁質酶及其同工酶，并表達了強植株可誘導產生幾丁質酶及其同工酶，并表達了強效抗病原體的細胞溶解活性，說明植物可識別病原效抗病原體的細胞溶解活性，說明植物

10、可識別病原體并可被誘導產生抗病原體的幾丁質酶。天然多糖體并可被誘導產生抗病原體的幾丁質酶。天然多糖如幾丁質、脫乙酰幾丁質及其低聚糖也具有強效細如幾丁質、脫乙酰幾丁質及其低聚糖也具有強效細胞溶解活性的幾丁質酶及其同工酶的各種功能。另胞溶解活性的幾丁質酶及其同工酶的各種功能。另外，多糖類誘導子除誘導改善植物次生代謝產物的外，多糖類誘導子除誘導改善植物次生代謝產物的產量外，還可通過多糖的膠化性質改變植物細胞膜產量外，還可通過多糖的膠化性質改變植物細胞膜的通透性及流動性。的通透性及流動性。（4）微生物類誘導子：通常是真菌誘導子，方法是將通常是真菌誘導子，方法是將其懸浮培養的菌球勻漿處理，再將漿液高壓滅

11、菌處其懸浮培養的菌球勻漿處理，再將漿液高壓滅菌處理，棄去殘渣，得提取物或無菌真菌菌絲體粗提物理，棄去殘渣，得提取物或無菌真菌菌絲體粗提物. .在無菌條件下將勻化產物加入到來源于不同組織、在無菌條件下將勻化產物加入到來源于不同組織、器官的細胞懸浮培養物中，同時作出作用時間曲線。器官的細胞懸浮培養物中，同時作出作用時間曲線。 在紫杉屬植物細胞培養物中為提高紫杉醇、紫杉在紫杉屬植物細胞培養物中為提高紫杉醇、紫杉堿的產量而向培養基中添加的誘導子為灰黃霉素、堿的產量而向培養基中添加的誘導子為灰黃霉素、灰葡萄孢、大麗輪枝孢和融黏帶酶的混合培養濾液，灰葡萄孢、大麗輪枝孢和融黏帶酶的混合培養濾液，還有人用葡萄

12、孢屬的無菌菌絲體勻化產物誘導處理還有人用葡萄孢屬的無菌菌絲體勻化產物誘導處理罌粟細胞培養物來積累血根堿。罌粟細胞培養物來積累血根堿。 不同誘導子作用于不同植物可以產生多種多樣的次生代謝產物，可見從植物抗病生理角度來看，這些次生代謝產物多為植保素( (植物抗病物質) )，而在人類生活中，這些代謝產物也多為有益于人類健康的活性成分. . 另一方面，誘導子運用于植物組織培養中亦存在一些問題。如內源性誘導子及酵母提取物是無毒的，而來如內源性誘導子及酵母提取物是無毒的，而來源于真菌的誘導子多有很強的毒性源于真菌的誘導子多有很強的毒性. .隨著植保素的誘隨著植保素的誘導合成，植物病原性真菌也誘導了一個過敏

13、反應，就導合成，植物病原性真菌也誘導了一個過敏反應，就是病毒與宿主細胞相互作用部位細胞的壞死，從而使是病毒與宿主細胞相互作用部位細胞的壞死，從而使細胞生長率下降，并可能影響次生代謝產物的產量。細胞生長率下降，并可能影響次生代謝產物的產量。 降低誘導子濃度可以減少生長的停止狀態，然而在誘降低誘導子濃度可以減少生長的停止狀態，然而在誘導子作用下形成次生代謝產物的過程中，低濃度的誘導子作用下形成次生代謝產物的過程中，低濃度的誘導子只能引起部分誘導，所以誘導的劑量不同，引起導子只能引起部分誘導，所以誘導的劑量不同，引起的效應也不同。誘導子在不同的作用時間都將在一定的效應也不同。誘導子在不同的作用時間都

14、將在一定程度上影響次生代謝產物的含量，如桔青霉誘導子對程度上影響次生代謝產物的含量，如桔青霉誘導子對紅豆杉培養細胞中紫杉醇生合成的影響實驗顯示，在紅豆杉培養細胞中紫杉醇生合成的影響實驗顯示，在紅豆杉細胞中指數生長期末期時加入誘導子，對紫杉紅豆杉細胞中指數生長期末期時加入誘導子，對紫杉醇合成的促進作用最大。醇合成的促進作用最大。 對于影響植物細胞培養物的生物量的增長和次生代謝產物的積累因素的變化，可因某一因素的調整而影響其他因素，所以在培養過程中要不斷的加以平衡和研究。 植物具有其本身的特殊性，因此對一種植物細胞或一種次生代謝產物適合的條件不一定適合于其它的次生代謝產物和細胞。 誘導子在植物細胞

15、培養物中對次生代謝產物的作用還有待于更進一步的系統研究。二、前體飼喂 前體飼喂是增加次級代謝產物產率的重要方法。 次級代謝產物的合成依賴于三種主要原材料的供應：莽草酸是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前體；氨基酸，形成生物堿及肽類抗生素；乙酸是聚乙炔類、前列腺素類、大環抗生素、多酚類、類異戊二烯等的前體。 基本出發點是在細胞外創造一個次級代謝產物的貯存單元。在培養時可入固相或疏水液相，形成相培養系統，從而達到收集分泌物的目的。 該法可以減輕產物本身對細胞代謝的抑制作用，并可保護產物免受培養基中催化酶或酸的影響。可簡化下游處理過程，降低生產成本。三、兩相法培養 四、轉基本技術在次級代謝產物生

16、產中的應用1.冠癭組織和毛狀根培養技術冠癭組織是植物受發根農桿菌和根癭農桿菌感染后，農桿菌將質粒中的一段轉移dna片段整合到植物細胞核的dna編碼基因上，從而作為表現型在感染處長出的冠癭瘤/毛狀根。將冠癭瘤/毛狀根作為培養系統，可進行有用化合物的生產。五、植物生物轉化技術與生物制藥 利用植物細胞培養以及植物酶對外源底物進行生物轉化，從而得到人們想要的目標化合物，稱為植物生物轉化技術。 許多利用植物細胞和酶系統進行的生物轉化具有部位以及立體特異性，其反應類型包括氧化反應、還原反應、羥化反應、甲基化反應、乙酰化反應、異構反應、糖基化反應以及酯化反應等。 生物轉化（biotransformation

17、,bioconversion），也稱生物催化（biocatalysis），是指利用生物離體培養細胞或器官及細胞器等對外源化合物進行結構修飾而獲得有價值產物的生理生化反應，其本質是利用生物體系本身所產生的酶對外源化合物進行酶催化反應。 具有反應選擇性強（立體選擇性、位置選擇性）、反應條件溫和、副產物少、不造成環境污染和后處理簡單等優點，并且可以進行傳統有機合成不能或很難進行的化學反應。1.概述作為生物催化劑，植物細胞培養具有下列優點：可以在實驗室中生長，實驗重現性好可以在實驗室中生長，實驗重現性好細胞可以無限制的生長，培養物可以大量累積細胞可以無限制的生長，培養物可以大量累積生長循環周期短生長循

18、環周期短利用催生物及其產生的酶進行生物轉化，所具有的的優點是生物量倍增時間短，微生物的基因操作方法已廣泛建立。而植物生物轉化系統與之相比，生物量倍增時間較長，產生酶的種類較少且酶量低微。但植物生物轉化還是有它獨特之處：植物中具有許多微生物中不存在的獨特的酶。 利用植物進行生物轉化的化合物可以是植物在其代謝過程中產生的中間體，也可以是人工合成的化合物。 植物生物轉化系統可以與有機合成結合使用，相得益彰。 植物細胞培養具有巨大的產生特定次生代謝產物的潛力，在某些細胞培養物中，雖然不能完成一些重要的次生代謝產物的形成和累積，但保留了將外源底物轉化為有用產物的能力。 生物轉化既可產生新的化合物，又可改

19、造已有的化合物、增加目標產物的產量以及克服化學合成的缺點，而且可通過中間代謝產物的研究闡明化合物的生物合成途徑。 許多因素都能影響植物細胞和器官培養物進行的生物轉化，例如，前體物的溶解性、細胞的通透性、有活性的酶量、酶的存在位置、副反應的存在、參加降解目的產物的酶量、誘導作用、ph變化以及滲透作用等。 通過引入環糊精可以使某些難溶或不溶于水的物質改進水溶性，使之更容易進行生物轉化。 使用有機溶劑（如異丙醇、二甲亞砜和多糖）都可能增大細胞的通透性，從而促進底物攝取及產物釋放，此外還有超聲波降解法、電極法和電泳釋放以及高電場脈沖和超高壓等。2.植物細胞和器官培養物的生物轉化 植物細胞培養和毛狀根培

20、養所進行的生物轉化為具有治療活性的化合物的結構改造提供了一個重要工具。但是懸浮培養的最大缺點就是體細胞克隆不穩定，但是懸浮培養的最大缺點就是體細胞克隆不穩定，利用組織進行培養時也存在這一問題。利用組織進行培養時也存在這一問題。而毛狀根培養則屬于器官培養，具有分化性，其遺而毛狀根培養則屬于器官培養，具有分化性，其遺傳穩定性培養，因此代謝產量也非常穩定。傳穩定性培養，因此代謝產量也非常穩定。許多因素會影響毛狀根的藥用次生代謝產物的產生，許多因素會影響毛狀根的藥用次生代謝產物的產生，例如營養成分、誘導子、產物生物轉化的前體以及例如營養成分、誘導子、產物生物轉化的前體以及對發根農桿菌對發根農桿菌rir

21、i質粒的遺傳改造等。質粒的遺傳改造等。 通過植物細胞培養物進行生物轉化，是一種可以對分子進行結構修飾而使其成為活性化合物的工具。 一些比較重要的生物轉化類型有：羥基化；糖基化；醇和酮的氧化還原反應；水解反應；環氧化作用；羰基還原反應；碳-碳雙鍵的還原反應；硝基還原反應等。 細胞培養產生次生代謝產物的方法的改進通常與植物細胞的器官化和分化有關，而器官化和分化的理論則是固定化技術應用的基礎。 利用固定化細胞培養進行生物轉化外源底物，具有突出優勢：細胞抗剪切能力增強；可以長期重復使用；可能產生較多的生物材料，從而轉化更多底物；細胞的恢復更容易；產品后期化學處理更容易。3.利用固定化細胞培養進行生物轉

22、化 固定酶系統具有一定的局限制：被分離的酶在極限ph、加熱和加入特定有機溶劑時很容易引起變性，在分離酶的過程中酶的活性會有損失，常常應用于單步反應中。 而固定化植物細胞培養與固定酶系統相比，比起固定酶系統而言，作為生物催化劑更具獨特的優勢。可實行多步酶反應；選擇高效生物合成細可實行多步酶反應；選擇高效生物合成細胞，其催化活性也可增加；不需提供輔因子；更容胞，其催化活性也可增加；不需提供輔因子；更容易操作。全細胞固定化培養還可以創造一種類似全易操作。全細胞固定化培養還可以創造一種類似全植物的有機組織的微環境，導致細胞分化并且產生植物的有機組織的微環境，導致細胞分化并且產生較多的次生代謝產物。較多

23、的次生代謝產物。4.基因工程方法在生物轉化中的應用 植物轉基因技術應用于生物轉化的方法：將編碼催化生物合成反應的關鍵酶基因轉入到真菌或細菌細胞中去增殖，然后再把這個克隆的基因轉入到植物當中，并在其中表達。 植物轉基因技術能夠有效地產生和改造現有的生物轉化過程，而且有利于研究基因功能和生理性調節及其發展過程。5.利用植物酶進行生物轉化利用從植物中分離出來的以自由或固定狀態存在的酶，也可以催化一些重要的反應，進行生物轉化。 木瓜蛋白酶 氧腈酶 環化酶 酚氧化酶 鹵化過氧化酶 脂氧酶 細胞色素p450單氧化酶。1. callus culture - creation of genetic varia

24、nts via somaclonal variation and/or in vitro selection - elimination of pathogens esp. viruses - gene transfer (eg via agrobacterium, microprojectiles2. meristem culture- clonal propagation- elimination of pathogens- germplasm collection and long-term storage (eg cryopreservation)vi rus el i m i nat

25、 i onw hy does t he m eri st em have l ow / no vi rus t i t re? vi rus spreads pri m ari l y t hrough vascul ar syst em -t hi s i s not devel oped i n t he m eri st em m i t osi s and chrom osom e repl i cat i on com pet e w i t h vi rus repl i cat i on hi gh auxi n i n m eri st em i nhi bi t s vi rus repl i cat i on a vi rus “ i nact i vat i ng” syst em has great est act i vi t y i n m eri st emtobacco m