1、緒論名詞解釋 1.外植體(explant)：由活植物體(in vivo)上切取下來以進行培養(yǎng)的那部分組織或器官。離體培養(yǎng)的材料，包括：器官、組織、細胞、原生質(zhì)體。 2.愈傷組織：在組織培養(yǎng)中指在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團無序生長的薄壁細胞。3.細胞全能性：植物體的每一個細胞都含有一個完整個體的全套基因，這些基因在適宜的外界條件下按照某種特定的程序先后表達，最終分化形成一個完整的植株。 4.脫分化：一個成熟細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)并形成未分化的愈傷組織的現(xiàn)象叫做脫分化。5.再分化：一個成熟的植物細胞經(jīng)歷了脫分化之后，經(jīng)過培養(yǎng)還能形成完整的植株。再分化的過程有兩種方式：器官發(fā)生方式，胚胎發(fā)生方式。

2、6.再生：指組織、器官、懸浮細胞和原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)后獲得植株的過程。7.繼代：植物組織培養(yǎng)過程中，外植體在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間以后需要轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，稱為繼代。 8、初代培養(yǎng)；接種某些外植體后，最初的幾代培養(yǎng)，旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即9、消毒:是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。10、滅菌:是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，把所有生命的物質(zhì)全部殺死。簡答1.什么是植物組織培養(yǎng)？有哪些類型？ （1）植物組織培養(yǎng)(plant tissue culture)是指在無菌和人工控制的條件下，利用適當?shù)呐囵B(yǎng)基，對離體的植物器官（如根、

3、莖、葉、花、果實、種子、胚、花藥、子房等）、組織（如形成層、皮層、胚乳等）、細胞（如體細胞、生殖細胞花粉等）、原生質(zhì)、幼小的植株進行培養(yǎng)，使其再生細胞或完整的植株的技術(shù)。 （2）組織培養(yǎng)分為五種類型：胚胎培養(yǎng)，器官培養(yǎng)（根、莖、葉、花、果實等），組織培養(yǎng)（莖尖分生組織、形成層、表皮組織等），細胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)。又可以根據(jù)培養(yǎng)方式的不同，分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)（紙橋，靜置，旋轉(zhuǎn)，震蕩培養(yǎng)四種方式）。2.什么是細胞全能性學(xué)說？如何理解?（1）細胞全能性學(xué)說，即植物體的每一個細胞都含有一個完整個體的全套基因，這些基因在適宜的外界條件下按照某種特定的程序先后表達，最終分化形成一個完整的植株，稱為細

4、胞全能性（totipotency)（2）必須滿足兩個條件： 一是要把這些細胞從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來，也就是說必須使部分細胞處于離體的條件下。 二是要給予它們適當?shù)拇碳?，即給予它們一定的營養(yǎng)物質(zhì)，并使它們受到一定的激素的作用。（3）全能性體現(xiàn)的兩個過程 一個已分化的細胞要表現(xiàn)它的全能性，必須經(jīng)歷兩個過程，即首先要經(jīng)歷脫分化過程，然后再經(jīng)歷再分化過程。3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成：（1）無機營養(yǎng)大量元素：氮、磷、鉀、硫、鈣、鎂；濃度大于0.5mmol（2）無機營養(yǎng)微量元素：鐵、硼、錳、銅、鋅、鉬、氯；濃度小于0.5mmol（3）有機營養(yǎng)：維生素、肌醇、氨基酸等（4）植物生長調(diào)節(jié)劑：生長素類

5、（2，4-D、NAA、 IAA、 IBA)，細胞分裂素類(KT BA ZT )，其他類（GA ABA)（5）附加物: 瓊脂、活性碳、一些天然復(fù)合物。4、組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用可以有以下10個方面：（1）組織培養(yǎng)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)不可或缺的組成部分，無論是轉(zhuǎn)基因受體的提供，還是轉(zhuǎn)化細胞的篩選和再生，都需要有組織培養(yǎng)技術(shù)作為支撐。（2）在自花授粉作物雜交育種中，或在異花授粉作物自交系選育過程中，采用花藥培養(yǎng)技術(shù)不但可縮短雜合體純合化所需的時間，而且還可以節(jié)省土地面積。（3）在某些雌雄異株植物(如石刁柏)中，若把花藥培養(yǎng)技術(shù)包括到制種程序中去，在后代就有可能得到均勻一致的單性群體，提高經(jīng)濟效益。（4）在遠

6、緣雜交中，通過離體授粉或原生質(zhì)體融合有可能克服受精前障礙，在通過幼齡合子胚培養(yǎng)可以克服受精后障礙，通過體細胞融合還有可能制造出細胞質(zhì)雜種。（5）對于無藥可治的病毒病，可通過莖尖培養(yǎng)消除病毒，這對解決馬鈴薯種薯退化問題能發(fā)揮重要的作用，在其他很多植物中也可用以建立無毒原種。（6）通過離體誘導(dǎo)不定芽或促進腋芽生枝，可對很多重要的園藝植物和名貴花卉、樹種進行快速繁殖。（7）應(yīng)用在細胞水平上進行突變體選擇的技術(shù)，可以在一定程度上使高等植物的育種程序微生物化，從而大大提高選擇效率，節(jié)省時間和土地面積，并且不受季節(jié)的限制。（8）體細胞無性系變異是除有性雜交和理化誘變之外的第三個變異來源。（9）通過用人工種

7、皮包被體細胞胚制造人工種子，為某些稀有和珍貴物種的繁殖提供了一種高效的手段。（10）在無性繁殖植物中，通過對莖尖分生組織等離體材料進行超低溫保存，不但可以大大節(jié)省空間，而且還可以避免病蟲害的侵襲。第一章1、組織培養(yǎng)室的組成：準備室，溫室，馴化室，培養(yǎng)室，無菌操作室，緩沖室。2、接種器具：鑷子、剪刀、解剖刀等，培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架等。3、培養(yǎng)基的成分：無機營養(yǎng)物，有機營養(yǎng)物（碳水化合物，維生素，肌醇，氨基酸），植物生長調(diào)節(jié)劑，碳水化合物以及其他添加物。4、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有哪幾類，及其主要類型與作用。（1）主要有生長素類，細胞分裂素類，赤霉素。（2）生長素類。作用：主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織

8、形成；促進細胞脫分化；促進細胞伸長；促進生根。在配置生長素溶液時，溶于95%乙醇或1mol/LNaOH。常用的生長素有吲哚乙酸（IAA），2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。IBA是促進發(fā)根能力較強的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。2,4D起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成。誘導(dǎo)愈傷組織的能力：2,4-D>NAA>IBA>IAA。 (3)細胞分裂素作用：促進細胞分裂與擴大。誘導(dǎo)芽分化，促進側(cè)芽萌發(fā)，使莖增粗，抑制莖伸長。 抑制根的分化。種類：

9、6BA(6芐基腺嘌呤)，Kt (kinetin 激動素)，Zt (zeatin 玉米素)。其中最常用的是6BA。其中ZT活性最強，但昂貴，常用的是6BA。配置溶液時溶于1mol/L的HCl。作用強弱順序：Zt>6-BA>Kt (4)GA3（赤霉酸）：作用：促進幼芽伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株。易溶于水，但是不穩(wěn)定，常溶于95%酒精，配成母液。赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響：當生長素赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。 (5)脫落酸 適當加入ABA可明顯提高體細胞胚的數(shù)量和質(zhì)量，抑制異常體細胞胚的發(fā)生。 (6)乙烯 組織培養(yǎng)中，乙烯對培養(yǎng)物的生

10、長、胚胎發(fā)生或芽的形成有抑制作用。 抑制乙烯：可降低培養(yǎng)基中蔗糖的濃度，或用麥芽糖或葡萄糖代替蔗糖，也可添加一定濃度的硝酸銀（5-15mg/L）抑制乙烯形成。乙烯的合成途徑：蛋氨酸SAM ACC 乙烯成熟基因（PG,PE)?？刂埔蚁┖铣桑?ACC合酶 （ACC synthase)，ACC氧化酶（ACC oxidase）5、培養(yǎng)基中的有機成分及其作用 （1）、碳水化合物里，最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。使用濃度在1%5%，常用3% 作用：碳源；維持培養(yǎng)基滲透壓。 （2）、維生素，作用：在細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(

11、鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0110mgL。 （3）、肌醇，使用濃度：一般為lOOmgL，作用：適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。 （4）氨基酸，作用：是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。使用濃度：為10200mgL。種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。6如何利用植物激素調(diào)控愈傷組織形態(tài)的發(fā)生？形態(tài)發(fā)生有哪些途徑？生長素/細胞分裂素的比值與組織培養(yǎng)的關(guān)系: 比值大時有利于愈傷組織、根的形成，這時

12、生長素起主導(dǎo)作用；比值小時，則促進芽的形成，這時細胞分裂素起主導(dǎo)作用。 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生途徑 : 胚胎發(fā)生途徑 器官發(fā)生途徑 7、固體培養(yǎng)基最好的固化劑-瓊脂Agar。用量：6-10g/L。90時融化，40凝固。配制完的培養(yǎng)基滅好菌后要早點拿出來，防止瓊脂不凝固。滅菌時間過長則顏色會變深，pH高易于凝固。8、 抗生物質(zhì) 種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。濃度：520mg/L。作用：可防止菌類污染。9、 活性炭 目的：是利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響；利于生根；減少玻璃化。缺點：無選擇性，營養(yǎng)物質(zhì)和植物調(diào)節(jié)劑。使用濃度：15gL。10、 配制培養(yǎng)基時，水要用蒸餾水。11、 pH值 多數(shù)

13、植物要求pH5.6-5.8，用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI調(diào)節(jié).。注意：經(jīng)高壓滅菌后，培養(yǎng)基pH會下降0.2-0.8,固調(diào)整pH值時,應(yīng)高于0.5；pH的大小會影響瓊脂的凝固能力，當pH>6.0時，培養(yǎng)基將會變硬，pH <5.0時，瓊脂凝固不好。23、常用培養(yǎng)基的種類：MS培養(yǎng)基。無機離子濃度較高。White培養(yǎng)基 無機鹽濃度較低，適于生根培養(yǎng)或者胚培養(yǎng)，也可用于懸浮細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)。N6培養(yǎng)基 在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花粉和花藥培養(yǎng)。B5培養(yǎng)基 為培養(yǎng)大豆根細胞設(shè)計。KM8P培養(yǎng)基:為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。24、培養(yǎng)基的配制流程 （1）將母液按順

14、序擺放（2）取適量的蒸餾水(所需培養(yǎng)基量的2/3)入容器（3）按需要量依次取母液及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（4）加入蔗糖(30g/L)溶解（5）加瓊脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min（6）定容（7）調(diào)PH值(pH=5.8)（8）分裝培養(yǎng)瓶，封口（9）高壓滅菌25、常用的滅菌方法：物理方法，干熱滅菌，濕熱滅菌（培養(yǎng)基在配置完成24h之內(nèi)完成滅菌工序），射線處理，過濾除菌（不耐熱的物質(zhì)，濾膜網(wǎng)孔直徑為0.45m），大量無菌水沖洗。26、繼代中常會出現(xiàn)的問題（1）馴化現(xiàn)象：在植物組織培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)一些植物組織經(jīng)長期繼代培養(yǎng)，發(fā)生了一些變化。開始繼代培養(yǎng)要加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，其后加入少量或不加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)就可

15、以生長、這種現(xiàn)象稱為“馴化”。（2）玻璃化現(xiàn)象：當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明狀，呈水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。（3）衰退現(xiàn)象：培養(yǎng)材料經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)，而發(fā)生形態(tài)能力喪失、生長發(fā)育不良、再生能力降低和增值率下降的現(xiàn)象。27、試管苗移栽時的注意事項：（1）防止斷根；（2）選用生根粉（3）育苗基質(zhì)；（4）適當遮陰；（5）移栽后管理。第二章名詞解釋1. 植物快繁：利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對外植體進行離體培養(yǎng)，使其短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法，也稱植物快繁或微繁。 2. 叢生芽：定芽的萌動，形成微型的多枝多芽的小灌木叢狀結(jié)構(gòu)。如頂芽切取尖端，可產(chǎn)生無

16、病毒植株。 3、.原球莖：短縮的、珠粒狀的、胚性細胞、類似幼莖的器官，可增殖、形成原球莖叢。 4、.馴化：試管苗從異養(yǎng)到自養(yǎng)的轉(zhuǎn)變，是一個逐漸適應(yīng)的過程。5、.玻璃化現(xiàn)象：表現(xiàn)：試管苗葉片、嫩梢呈水浸透明或半透明狀。6. 褐化現(xiàn)象：表現(xiàn)：培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料逐漸變褐，導(dǎo)致植物體死亡的現(xiàn)象。7. 黃化現(xiàn)象：試管苗幼苗整株失綠，全部或部分黃化、斑駁的現(xiàn)象。 8.無性系：以茶樹單株營養(yǎng)體為材料，采用無性繁殖法繁殖的品種（品系）稱無性系品種9.無性系變異：培養(yǎng)物在培養(yǎng)階段發(fā)生變異，進而導(dǎo)致再生植株也發(fā)生遺傳改變的現(xiàn)象。簡答1、簡述植物快繁器官形成的5種方式及其特點？植物

17、快繁的器官再生方式分為：一、短枝發(fā)生型：外植體攜帶的帶葉莖段，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境下萌發(fā)，形成完整植株，再將其剪成帶葉莖段，繼代成苗的繁殖方法。與田間的扦插方法相似，也稱微繁扦插。優(yōu)點：一次成苗，遺傳性狀穩(wěn)定，培養(yǎng)過程簡單，移栽成活率高。應(yīng)用：花卉和葡萄試管苗的繁殖。二、叢生芽發(fā)生型：外植體攜帶的頂芽或腋芽，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中不斷發(fā)生腋芽而呈叢生芽狀態(tài)，將單個芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根成苗的繁殖方法。優(yōu)點：不經(jīng)過愈傷組織，保持性狀好。應(yīng)用：大多數(shù)植物試管苗的繁殖。三、不定芽發(fā)生型：外植體在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中，經(jīng)歷兩種途徑：a.經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，然后經(jīng)過再分化產(chǎn)生不定芽-器官發(fā)生型b.外植體不

18、形成愈傷組織而直接從其表面形成不定芽-器官型。將芽苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根成苗的繁殖方法。特點：增殖率高于叢生芽，但有變異發(fā)生。應(yīng)用：也是大多數(shù)植物試管苗的繁殖方式。四、胚狀體發(fā)生型：外植體在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中，經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生體細胞胚的繁殖方法。特點：不經(jīng)過生根培養(yǎng)，直接形成小植株。成苗數(shù)量大，速度快，結(jié)構(gòu)完整。五、原球莖發(fā)生型：莖尖或腋芽外植體誘導(dǎo)成原球莖，切割原球莖進行增殖，或停止切割使其繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)綠，產(chǎn)生毛狀假根的繁殖方法。應(yīng)用于蘭科植物快繁。2、快繁的過程：無菌培養(yǎng)物的建立：繁殖體增殖：芽苗生根：小植株的移栽馴化3、影響快繁的因素：外植體，培養(yǎng)基（MS，糖），培養(yǎng)條件，繼代培養(yǎng)，移栽4

19、、馴化原則：從溫，光，濕度及有無雜菌等環(huán)境因素考慮，馴化開始數(shù)天內(nèi)，與培養(yǎng)環(huán)境條件相似，后期與預(yù)期栽培環(huán)境相似，逐步適應(yīng)。 5、試管苗移栽的步驟（1）輕輕地洗掉粘在根上的瓊脂培養(yǎng)基。（2）移栽時,把小植株的一部分葉片剪掉也可能是有益的。（3）移栽后，最初10-15天要通過噴霧或罩上透明塑料以保持很高的濕度（90-100%),在塑料罩上可打些小孔，以利氣體交換。（4）在保濕數(shù)天之后，可把植株搬入溫室，但仍需遮蔭數(shù)日。移栽后要完成上述各個步驟可能需花費4-6周時間，此后即可讓這些植株在正常的室溫條件下生長。6、褐變的發(fā)生，影響因素及處理方法（1）外植體褐變：多酚氧化酶是植物體內(nèi)普遍存在的一類末端氧

20、化酶，它催化酚類化合物形成醌和水，醌再經(jīng)非酶促聚合形成深色物質(zhì)，對植物體材料產(chǎn)生毒害作用。（2）褐變的影響因素：1、植物種類及基因型。2、外植體的部位及生理狀態(tài)。3、外植體的受傷程度。4培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件。5、培養(yǎng)時間過長（3）防止褐變的方法：選擇適宜的處植體；對外植體進行處理，如先進行低溫處理，再放入只含糖的瓊脂培養(yǎng)基中，使酚類物質(zhì)滲入到培養(yǎng)基中；選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件；添加褐變抑制劑和吸附劑。如維生素C等連續(xù)轉(zhuǎn)移。減輕酚類化合物的毒害。7、玻璃化現(xiàn)象：在進行植物組織培養(yǎng)時，經(jīng)常會出現(xiàn)試管苗生長異常，葉等出現(xiàn)透明或半透明的水浸狀植物矮小腫脹，失綠等現(xiàn)象稱為玻璃化現(xiàn)象。機理：在芽分化啟

21、動后，某些生物分子發(fā)生生理變化，內(nèi)源乙烯過剩，誘發(fā)了其他激素質(zhì)和量的改變。防止玻璃化措施：1、增加瓊脂濃度。2、提高糖的含量或加入滲透劑，降低培養(yǎng)基中滲透勢，減少植物材料可獲得的水分。3、降低培養(yǎng)基中細胞分裂素的含量4、增加光照、控制溫度、改善通風換氣條件。植物體脫毒技術(shù)名詞解釋1、莖尖:是由頂端分生組織及其下方的1-3個幼葉原基組成的. 2、原原種：脫毒試管苗出瓶移栽后的苗木稱作原原種,一般保存在科研單位的隔離網(wǎng)室內(nèi)3、原種:原原種繁殖的苗木稱作原種 4、微體嫁接法：將極小的莖尖（0.14-1.0mm）作為接穗嫁接不帶病毒的種子實生苗砧木上，然后將砧木、接穗一起在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。5、珠心組織培

22、養(yǎng)脫毒法：病毒通過維管組織傳播，而珠心組織與維管組織沒有直接聯(lián)系，故可以通過珠心組織培養(yǎng)獲得無病毒植株。二、簡答1.簡述植物脫毒方法的種類？莖尖培養(yǎng)脫毒法，熱處理脫毒法，微體嫁接法，珠心組織培養(yǎng)脫毒法，愈傷組織培養(yǎng)脫毒法2、簡述植物莖尖脫毒方法的原理？ 病毒是DNA大分子，它侵染植物后可進入植物細胞。當植物細胞分裂時，病毒DNA隨著復(fù)制。因此，植物細胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭，在迅速分裂的植物細胞中，是正常核蛋白合成占優(yōu)勢，而在植物細胞伸長期間，是病毒核蛋白合成占優(yōu)勢。生長點、分生組織細胞是活躍分裂的細胞。其分裂速度比病毒DNA復(fù)制速度快，故采用旺盛分裂的生長點離體培養(yǎng)，就有可能脫除植物

23、病毒。3、如何進行脫毒效果的檢測？ 視覺觀察法，生物鑒定法（利用嫁接法接種，把待測的植物接種在敏感植物上，然后視其有無病斑，來判斷是否脫除了病毒），電子顯微鏡鑒定法（用電子顯微鏡直接觀察經(jīng)脫毒培養(yǎng)的葉片，檢查是否有病毒粒子存在，還可測量病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)），抗血清鑒定法（利用抗原與抗體特異反應(yīng)的特性，用已知病毒的抗血清來鑒定未知病毒的種類，其中酶聯(lián)免役吸附反應(yīng)（ELISA）是常用的一種方法），分光光度法。4、植物病毒病的防治措施：1）、選育抗病品種 2）、消滅傳毒昆蟲 3）、用無性繁殖法培育無毒苗 4）、接種弱毒株來保護植物 5）、采用合理的栽培措施等5、植物脫毒的意義1）、能夠有效地

24、保持優(yōu)良品種的特性2）、快速繁殖品種，使優(yōu)良品種迅速應(yīng)用3）、生產(chǎn)無病毒種苗，防止品種退化4）、節(jié)約耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品的商品率5）、便于運輸?shù)谌?1、 植物細胞培養(yǎng)（plant cell culture）：是在離體條件下，將愈傷組織或其他易分離的組織置于液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。優(yōu)點：操作簡便、重復(fù)性好、群體大等。分類：植物細胞培養(yǎng)的特性（1）植物細胞較微生物細胞大得多，有纖維素細胞壁。（2）培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；（3）細胞生長的中期及對數(shù)期易凝聚為團塊，不能象微生物一樣均勻分散，懸浮培養(yǎng)較難

25、；(4）培養(yǎng)時需供氧。（5）因為有細胞壁, 培養(yǎng)細胞產(chǎn)物滯留于細胞內(nèi)，產(chǎn)量較低；（6）細胞培養(yǎng)過程有結(jié)構(gòu)與功能全能性,因而易分化。（7）懸浮培養(yǎng)中要求有一定的細胞濃度，否則不生長（25000-50000個/ML）。植物細胞培養(yǎng)需要解決的問題（1）氧和二氧化碳的控制，過多氧過少氧均不利于生長；（2）營養(yǎng)物的供應(yīng)；（3）細胞密度過高引起細胞團聚甚至分化，培養(yǎng)過程中細胞的分化的防止，（4）細胞取得中微生物的去除；植物細胞培養(yǎng)的意義：（1）研究細胞生理代謝過程及各種影響因子；（2）用于植物品種的改良；（3）用于植物次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。 （生產(chǎn)藥物、食品添加劑、農(nóng)藥、飼料等。）一、單細胞分離 機械法和酶

26、解法（果膠酶處理）2、 單細胞培養(yǎng) 單細胞培養(yǎng)：對分離得到的單個細胞進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分裂增殖，形成細胞團，再通過細胞分化形成芽、根等器官或胚狀體，直到長成完整植株的技術(shù)。 平板培養(yǎng)法（將一定濃度的單細胞懸浮液接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過程）、 看護培養(yǎng)（指利用生長的愈傷組織所產(chǎn)生的物質(zhì)來培養(yǎng)單細胞或者異種愈傷組織等的方法）、 微室培養(yǎng)（在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，置于微室中培養(yǎng)，使其分裂增殖形成細胞團的方法） 紙橋培養(yǎng)法（是指植物莖尖分生組織培養(yǎng)常用的方法，有時也可用于單細胞培養(yǎng)）三、細胞懸浮培養(yǎng)1、定義：將單個游離單細胞或小細胞團按一定密度懸浮在液

27、體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)增殖的技術(shù)。又分為成批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。成批培養(yǎng)（分批培養(yǎng)）是在一個封閉的系統(tǒng)中進行細胞培養(yǎng)，當培養(yǎng)物增加到一定量時，需繼代培養(yǎng)，即取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。連續(xù)培養(yǎng)是用一定容積的非密閉系統(tǒng)進行細胞培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)過程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使營養(yǎng)物連續(xù)得到補充，細胞生長和增殖連續(xù)進行，同時有等體積的培養(yǎng)物排除系統(tǒng)。分為封閉型和開放型連續(xù)培養(yǎng)兩種。分批培養(yǎng)：將愈傷組織培養(yǎng)在一定容積的密閉容器中進行培養(yǎng)。特點：培養(yǎng)基體積固定；細胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈S增長。分批培養(yǎng)中細胞生長各個時期的特點：滯后期：細胞很少分裂，其長短與接種量大小和繼代時原種細胞所處的生長期有關(guān)對數(shù)

28、生長期：細胞分裂活躍，細胞數(shù)目增加，增長速率保持不變直線生長期：細胞生長和發(fā)育最明顯的時期緩慢期：生長逐漸緩慢：培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增多，氧氣減少靜止期：生長幾乎處于停止狀態(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。開放式連續(xù)培養(yǎng)：排出液中的細胞用機械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細胞數(shù)目不斷增加；封閉式連續(xù)培養(yǎng)：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時，培養(yǎng)細胞隨同培養(yǎng)液一起流出，培養(yǎng)細胞數(shù)目保持恒定；通過調(diào)節(jié)流入和流出的速度，使培養(yǎng)物的生長速度永遠保持接近最高值的恒定水平上。2、 懸浮培養(yǎng)的步驟：愈傷組織誘導(dǎo)，懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)，懸浮細胞的生長動態(tài)，懸浮培養(yǎng)細胞的同步化3、 細胞同步化是指同一懸

29、浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。4、 同步化的方法：（1）分選法 梯度離心、過濾；根據(jù)細胞體積大小分級，將懸浮細胞通過20、30、40、60目的濾網(wǎng)過濾，培養(yǎng)，再過濾，重復(fù)幾次即可獲得同步化較高的細胞。優(yōu)點：操作簡便，維持了細胞的自然生長狀態(tài)。缺點：無細胞壁，形狀不規(guī)則，分選精細程度較差。（2）低溫處理 4DNA合成受阻，細胞趨向G1期。（3）饑餓法 細胞生長所需的營養(yǎng)成分喪失，導(dǎo)致細胞因饑餓而分裂受阻，停留在某一時期，加入所缺成分后又恢復(fù)。N、P同時饑餓處理一種海藻50 h，有二分之一的細胞處于G1期。（4）抑制劑法 DNA合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶。細胞不能合成DN

30、A，處于G1和S期。四、次生代謝產(chǎn)物積累1、次生代謝產(chǎn)物：是指有些生物體利用某些初生代謝產(chǎn)物 為“原料”,在一系列酶的催化下,形成一些特殊的化學(xué)物質(zhì)的過程,這些特殊的化學(xué)物質(zhì)即為次生代謝產(chǎn)物。2、植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型及結(jié)構(gòu)特點3、次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中存在的問題（1）細胞的增殖與次生物質(zhì)的合成速度不夠理想；（2）代謝產(chǎn)物的釋放問題；（3）生長激素是否安全問題；（4）生產(chǎn)成本較高的問題。第四章 轉(zhuǎn)基因技術(shù)1、目的基因的分離 (1)文庫法（cDNA文庫，基因組文庫）(2)PCR法(3)目的基因的化學(xué)合成2、轉(zhuǎn)基因方法概括起來主要有兩類：外源目的的DNA直接轉(zhuǎn)化，或者叫直接導(dǎo)入法。如基因槍法；電擊法；花粉管通道法。以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。3、轉(zhuǎn)基因植株的檢測方法（1） 報告基因檢測（2） DNA水平檢測（PCR，southern blot 檢測插入基因的拷貝數(shù)，RT-PCR檢測和熒光定量PCR和Northern blot為轉(zhuǎn)錄水平的檢測。（3）蛋白水平的檢測,第五章 植物花藥和花粉培養(yǎng)一、名詞解釋：單倍體：指的是具有配子