1、高效液相色譜對芥子油苷的提取和分離I 準備階段： 1. 水浴鍋設置80 2.配制兩瓶70%的甲醇，其中一瓶置于水浴鍋中溫浴。 3.5mM芐基芥子油苷.2.33mg/ml 4.0.5M醋酸鹽（PH=5）30mlHAC，960ml H2O，加10-20g NaOH粉末，調至PH=5 5.20mM的醋酸鹽，PH=5：將4中的稀釋25倍 6.DEAE sephadex A-25：稱取3g 樹脂，加90ml 0.5M 醋酸鹽（PH=5）室溫過夜溶解。 7.硫酸酯酶：15mg溶解于6ml 20mM 醋酸鈉中，PH=5（16100uM/hour/g）II 芥子油提取 1. 取新鮮蓮座葉，鮮重5-10mg 2

2、. 放入1.5mlEP管中，迅速放入液氮。 3. 研磨成粉末后并加入1ml 預熱的70%的甲醇。 4. 加入50ul 5mM 的芐基芥子油苷 5. 蓋好蓋子漩渦震蕩置于冰上，剩下的樣品重復步驟3-4。 6. 所有的樣品置于8010min。 7. 4000rpm，10min。 8. 將上清液轉移至1.5 的離心管。 9. 用預熱的甲醇重新提取兩次，收集所有的上清液至4ml，-20保存。III 芥子油苷的脫硫純化 1. 攪拌DEAE sephadex A-25 樹脂成溶液，用1ml的移液器取1ml加入BioRad 管中，讓其沉淀。 2. 用5ml 的滅菌水清洗（禁止干燥）。 3. 加入所有的芥子油

3、苷提取液。 4. 用2ml的70%的甲醇清洗兩次，2ml 的滅菌水清洗5次，2ml 20mM 醋酸鹽PH=5清洗一次。 5. 加入0.5ml 硫酸酯酶，直至上側的橡膠管中剩余1-2mm的液相。IV 脫硫芥子油苷的洗脫 1. 用1ml 滅菌水洗脫3次。 2. 濃縮至EP 管中剩余0.5ml 液體V HPLC分離脫硫芥子油苷 1. 取60ul 洗脫液于HPLC管中，吸入30ul 2. 檢測：PDA 190nm-370nm （或者DV229nm和260nm） 3. 流速：1ml/min 4. 運行梯度：滅菌水（A）和甲醇（B），60min A100%,B0% 2min A to 60%B線性 48m

4、in，60%B to 100% B 線性 3min A 0%，B100% 3min B to 100% A 線性 4minVI 芥子油苷的HPLC-MS 5. 取60ul 洗脫液加入HPLC管中，吸入6ul 6. 檢測：質譜，M+Na+ 7. 流速：0.25ml/min 8. 運行梯度：混有50uM的醋酸鈉滅菌水（A）與甲醇（B），60min A100%,B0% 2min A to 60%B線性 40min，60%B to 100% B 線性 5min A 0%，B100% 5min B to 100% A 線性 8min液相色譜質譜聯用分離、鑒定芥藍中脫硫芥子油苷臘貴曉,方萍,李亞娟,王月1

5、.芥子油苷的提取和純化稱取0. 20 g凍干樣品,加入3 mL 70%甲醇(甲醇水= 70 30),在70的水浴鍋中提取10 min,然后4000 r min- 1離心10 min.沉淀再按照上述方法提取2次,合并上述提取液.同時做2個平行.取2 mL提取液流經DEAESephadex A-25萃取柱,待提取液全部流出小柱后,加入200 L硫酸酯酶(0. 1%)溶液.室溫反應16 h后用4× 0. 5 mL超純水洗脫.洗脫液過0. 45m微膜,4下保存,待HPLC分析.利用2-丙烯基芥子油苷(sinigrin)作為外標進行定量.2.芥子油苷的測定與鑒定測定芥子油苷的主要方法包括氣相色

6、譜法測定其降解產物異硫代氰酸鹽化合物;高效液相色譜法測定脫硫芥子油苷和完形芥子油苷.對芥子油苷的鑒定一般采用質譜法,包括化學電離、快速原子轟擊電離及熱噴霧電離等方法. 1.超高效液相色譜法測定擬南芥芥子油苷 J東北農業大學學報，石璐，李夢莎，國靜等摘 要：將已有的擬南芥芥子油苷高效液相色譜（HPLC）檢測方法轉換為超高效液相色譜（UPLC）方法，通過條件優化改進，建立擬南芥芥子油苷UPLC檢測方法。該方法采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 m），以超純水和甲醇為流動相進行梯度洗脫，流速為0.40 mL·min-1

7、，檢測波長229 nm，進樣量5 L，內標為苯甲基芥子油苷。2.芥藍芥子油苷提取條件優化研究臘貴曉1， 孔海民2， 方 萍3， 楊鐵鋼1*摘 要:采用正交試驗設計，研究了提取溫度、提取劑甲醇濃度( V/V) 、提取時間和待測物質與提取液比例( 簡稱“物液比”) 對芥藍菜薹中芥子油苷( 總芥子油苷含量、總脂肪族芥子油苷和總吲哚族芥子油苷) 提取效果的影響。結果表明，物液比和提取溫度對總芥子油苷、總脂肪族芥子油苷和總吲哚族芥子油苷提取效果影響顯著( P005) ，而甲醇濃度和提取時間對芥子油苷提取率無顯著影響( P005) 。綜合考慮提取效果和成本，芥藍中芥子油苷最佳提取條件為 75，物液比 14

8、5( g mL) ，甲醇濃度 70%，提取時間 5 min。在該條件下，總芥子油苷提取量為831 mol/g DW，總脂肪族芥子油苷提取總量為758 mol/g DW，總吲哚族脂肪族芥子油苷提取總量為073 mol/g DW。3.中國甘藍型油菜硫苷含量及組份分析 李培武1，2，趙永國2，張 文2，丁小霞2，楊 湄3，汪雪芳3，謝從華1，傅廷棟1 （1）硫苷提取：準確稱取0.2000 g 已制備好的樣品至離心管中，于75水浴中保溫殺活 1 min，加入2 ml 70%甲醇提取液和 200 µl 內標，離心、轉移上清液至試管中，再加入2ml 70%甲醇提取并離心，共重復 3 次，混合上清液，取 2 ml 溶液上醋酸型DEAE-Sephadex A-25 陰離子交換柱，加硫酸酯酶 500 µl，于 36培養箱中酶解 20 h 后取出，用 1 ml 純水沖洗，待流干后再用1 ml純水沖洗，共沖洗3 次，混勻收集的洗脫液，用 0.45 µm的微孔濾膜過濾、封口，待上液相色譜儀分析。 （2） 高效液相色譜分析：使用美國 Waters 公司的液相色譜儀，包括兩臺高壓泵，自動進樣器，二極管陣列檢測器，色譜柱為 Spherisorb C18柱（150 mm×4 mm），流動相為 20%乙腈，檢測波長 229 nm，柱溫