1、大豆胰蛋白酶抑制劑對人宮頸癌Hela細胞增殖的影響【摘要】 目的 探討大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean trypsin inhibitor,SBTI )對人宮頸癌細胞（hela）體外增殖的影響。方法 選用hela細胞進行體外培養，采用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測SBTI對細胞增殖的影響。結果 在藥物濃度為0.5010.00g/L濃度時，隨著藥物濃度的增加，隨著作用時間的增加，SBTI對細胞增殖的抑制率明顯增強；在光鏡下可以看到細胞凋亡的特征形態。結論 SBTI對hela細胞的增殖有明顯的抑制作用，呈現量效，時效關系。 【關鍵詞】 大豆胰蛋白酶抑制劑 人宮頸癌細胞 細胞增殖Abstrac

2、t: Objective To study the influence of soybean trypsin inhibitor (Trypsin inhibitor.SBTI) on the human hela cells' (Ishikawa) proliferation in vitro. Methods Hela cells were cultured in vitro and effects of SBTI on cell proliferation were measured by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assa

3、y. Results For 0.201.00 g/L SBTI concentration, with the increasing concentration of the drug and with the duration of the same concentration, the inhibition to cell proliferation was significantly strengthened. The characteristics of the apoptosis can be observed under the light microscope. Conclus

4、ions SBTI markedly inhibited hela cells' proliferation on dose- effect and time- effect relationship. Key words:soybean trypsin inhibitor; the human hela cells; cell multiplication 宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤。患者年齡分布 呈雙峰狀，3539歲和6064歲，平均年齡52.5歲。宮頸癌不僅發病率居于首位，近年來發病年齡有提前的趨勢，探尋一種經濟有效的、非手術的、能夠免除平常化療藥物副作用的方法可謂當務之急。大

5、豆胰蛋白酶抑制劑是從大豆中提取的，是指能夠抑制胰蛋白酶作用的一類物質。國內外已經有文獻報道大豆胰蛋白酶抑制劑具有多種藥理活性，其中包括抗炎，抗病毒，抗腫瘤等?，F在人們在對結腸癌，前列腺癌，乳腺癌的研究已經證明大豆胰蛋白酶抑制劑有明顯的抗腫瘤作用1-3。大豆胰蛋白酶抑制劑已經受到人們的關注，成為研究的熱點。但是國內外關于大豆胰蛋白酶抑制劑對宮頸癌的研究報道較少。本實驗以細胞培養為基礎，對大豆胰蛋白酶抑制劑的抗腫瘤作用進行了初步研究，通過證明大豆胰蛋白酶抑制劑對宮頸癌細胞增殖的抑制作用，以期對臨床用藥和開發提供科學依據，積累實驗資料，現報告如下。1 材料和方法1.1 實驗材料1.1.1 藥品和試劑

6、大豆胰蛋白酶抑制劑為北京中醫藥大學細胞與生化實驗室提取（濃度為98%）；RPMI-1640培養基為美國Gibco公司產品，胎牛血清為杭州四季青血清；胰蛋白酶和EDTA均購于Ameresco公司。四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購于Sigma公司；HERAD6345型二氧化碳培養箱(德國赫利氏公司)；I71倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）;FCANF129004酶標儀(澳大利亞TECAN公司)。1.1.2 細胞株人宮頸癌細胞株（Hela）由北京病毒學研究所惠贈。1.1.3 培養液RPMI1640全培養液（RPMI1640+10胎牛血清+青鏈霉素100 U/mL及100 g/mL）。

7、1.2 實驗方法1.2.1 腫瘤細胞培養 Hela細胞使用含有10%胎牛血清的RPMI1640全培養液，在設定為37.0 、5%CO2 培養箱中培養。細胞可貼壁生長，待細胞生長貼滿底壁的80%左右時傳代。傳代時移去舊的培養液，用PBS洗滌2 次，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液消化，培養液重懸細胞于新培養液中，每瓶傳代為2或3 瓶。取對數生長期細胞用于實驗。1.2.2 MTT法測定細胞生長 將用上述方法培養得到的細胞消化，l 000 rpm離心10 min，計數，以2×105個/L密度接種于96孔培養板中，每孔100 L，在37.0 、5% CO2 培養箱培養

8、24 h后，加入濃度分別為0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L 的 SBTI (溶解在含10%胎牛血清的1640全培養液中)100 L。每一濃度各設6個平行孔，并分別設空白孔(即只加入藥液和培養液，不加細胞)以調零。繼續培養24、36、48 h后，每孔加入20 L MTT(5 g/L)，再培養4 h，棄上清，每孔加入150 L DMSO，振蕩器上震蕩10 min，應用酶標儀于490 nm處測吸光值（A），按照公式：抑制率=(對照組A實驗組A)/對照A×100，求抑制率。實驗在相同條件下均重復進行3 次。1.2.3 光鏡下形態學觀察 hela細胞接種于50 m

9、L培養瓶中，培養24 h后，加入0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L的SBTI，培養24 h后，光學顯微鏡下觀察細胞形態學變化，并拍攝照片。1.2.4 統計學處理 數據利用SPSS13.0統計軟件處理，求抑制率，采用重復測量的方差分析。并繪制出SBTI對Hela細胞抑制作用的量效和時效依賴關系曲線。 2 結果2.1 SBTI對Hela細胞增殖的抑制作用SBTI能夠明顯的抑制Hela細胞的增殖，并且呈現明顯的量效和時效依賴關系。在不同的作用時間分別是24、36、48 h，隨著藥物濃度（為0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L）的依次增加，抑制率依

10、次增加，最高可達83.24，87.83，96.01, 除了0.50 g/L與1.00 g/L組之間差異沒有顯著性（P>0.05）外，其他各組差異均有顯著性（P0.01）；在不同的作用濃度（如上的6個濃度），隨著作用時間（24，36，48 h）的依次增加，抑制率也依次增加，除了0.50 g/L和1.00 g/L組的24 h與36 h比較差異沒有顯著性（P>0.05）外，其他的均有有顯著性差異（P0.01），抑制率最高可達49.2%，59.77%,77.52%,80.92%,96.01%。見表1、圖1。表1 不同濃度大豆胰蛋白酶抑制劑在不同作用時間對Hela細胞的抑制率

11、（略）注：* 實驗組與對照組比較P0.01。#與前一組比較P0.01,與上一組比較P0.01但是0.50 g/L與1.00 g/L兩組間在24 h時差異沒有顯著性P>0.05, 0.50 g/L組的24 h與36 h比較差異沒有顯著性P>0.05，1.00 g/L組的24 h與36 h比較差異沒有顯著性P>0.052.2 SBTI對Hela細胞形態上的影響正常培養時，Hela細胞在傳代后陪培養34 h即可貼壁，呈現長橢圓形，10 h后貼壁結實，呈現多角形而且細胞大小不一，可見巨大細胞，胞質也多少不一，核大小不等，可有雙核。24 h后細胞呈現活躍的增殖。

12、4872 h后細胞生長貼滿一底壁，此期間細胞稱為對數生長期，見圖2，圖3。96 h后則由于細胞之間互相的抑制而不再增殖。在對數生長期的細胞，加藥不同濃度后培養24 h，可見1.00 g/L濃度的細胞不再增殖，細胞間距變大，而且貼壁不緊固，見圖4，10.00 g/L濃度的細胞，細胞大部分變圓，邊緣蹺起，且已脫離底壁，少量細胞聚集成一個一個的小細胞團，見圖5。 3 討 論 胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor ，TI)是指能夠抑制胰蛋白酶作用的一類物質。天然的胰蛋白酶抑制劑來源廣泛，動物植物以及人體內均含有TI，如可從黃豆、南瓜籽、牛肺或牛胰以及人尿中提取等。大豆胰蛋白酶抑制劑(so

13、ybean trypsin inhibitor ,SBTI)是從大豆中提取的 4，無毒副作用5，具有廣泛的生物學活性和作用，有著良好的科學研究和臨床治療前景。 腫瘤的發生有其遺傳物質基礎,主要表現為多基因突變所致的細胞失控性生長,細胞增殖失控和凋亡受阻是其發生、發展的主要原因,有效的抑制腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的新的手段之一。 大豆胰蛋白酶抑制劑具有抗腫瘤作用。Zhang6等研究了單純型的大豆胰蛋白酶抑制劑BBI 對人類乳腺癌細胞（MCF7）、人類頭頸腫瘤細胞 （SCC61 和 SQ20B） 、人類宮頸癌細胞（Hela ,Hela-R1 ,Hela-R3） 、非腫瘤生成性人類

14、上皮細胞 （MCF10）、非腫瘤生成性人類甲狀腺上皮細胞（Htori-3）及小鼠成纖維細胞（C3H10T1/2）的影響 ,結果顯示單純型的大豆胰蛋白酶抑制劑BBI 和結合型的大豆胰蛋白酶抑制劑BBIC 能夠顯著降低MCF7 和SCC61 細胞系的存活率。 有實驗證明大豆胰蛋白酶抑制劑具有明顯的抑制腫瘤細胞降解基質膜的作用，從而能夠抑制腫瘤細胞離開原來的生長部位，突破細胞外基質（ECM）的屏障和侵犯周圍毗鄰的正常組織7。 大豆胰蛋白酶抑制劑的還可以通過抑制腫瘤細胞的纖溶酶原激活系統起作用。這一系統包括:尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase type plasmino gen activat

15、or, uPA)及其受體(uPAR)和uPA抑制劑。大豆胰蛋白酶抑制劑與目前研究較為成熟的尿胰蛋白酶抑制劑（B ikunin）有著類似的作用，即與uPA結合形成一個復合體,并競爭地與uPAR 結合,封閉uPAR 的激活部位,使uPA酶活性不被激活,從而防止腫瘤細胞的轉移和浸潤。Kobayashi等8研究發現,腫瘤可分泌大量uPA,分泌后隨即與腫瘤細胞表面的uPAR高度結合,活化的uPA再催化細胞表面的纖溶酶產生蛋白溶解級聯反應,導致基底膜和細胞外基質被破壞。Kobayashi 等9 通過Northernblot、Western blot、酶聯免疫吸附法等證實,SBTI以一種時間及劑量依賴形式,

16、在基因及蛋白水平抑制卵巢癌細胞系HOC和HRA 的uPA 表達。 另外，大豆胰蛋白酶抑制劑調節信號傳導途徑而抑制腫瘤細胞的生長。大豆胰蛋白酶抑制劑通過直接抑制CD44 的二聚化抑制腫瘤轉移。白細胞分化抗原CD44是一種多功能跨膜糖蛋白,它促進腫瘤細胞粘附、遷移,參與新生血管形成等一系列關鍵步驟。Kobayashi等10對人類軟骨肉瘤細胞系HCS22 /8研究顯示,腫瘤細胞間是通過CD44相互識別透明質酸,其相互作用是通過CD44蛋白二聚化完成。SBTI 通過直接抑制CD44二聚化介導激活的促細胞分裂原活化蛋白激酶系統,從而抑制uPA mRNA及其蛋白的表達及腫瘤的侵襲。 本實驗用大豆胰蛋白酶抑

17、制劑處理人宮頸癌細胞Hela細胞后,Hela細胞的生長受到明顯抑制, 隨著藥物濃度為0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L依次增加，作用時間為24、36、48 h的依次延長，其抑制率也明顯增加。并且出現凋亡的特征性改變：細胞大部分變圓，邊緣蹺起，且已脫離底壁，少量細胞聚集成一個一個的小細胞團，并隨著藥物濃度的增加，細胞均漂起，聚集成一個一個的大細胞團。這些結果表明大豆胰蛋白酶抑制劑能抑制Hela細胞增殖，與文獻報道相似這可能是誘導Hela細胞發生凋亡有關。有關于大豆胰蛋白酶抑制劑抑制Hela細胞的機理方面我們將在以后做進一步的研究。 總之，大豆胰蛋白酶抑制劑，作為一種新

18、型又無毒副作用的抗癌藥，很有值得研究的價值，尤其我國是一個大豆資源豐富的國家，對其機制的深入研究，將對臨床腫瘤治療步入一個新的階段有著重要的意義?！緟⒖嘉墨I】 1Kennedy AR, Billings PC, Wan XS, et al. Effectsof Bowman-Birk inhibitor on rat colon carcinogenesis J . Nutr Cancer,2002 ,43 （2）:174-186.2Wan XS, Ware JH, Zhang L , et al. Treatment with soybean derived Bowman-Birk ihib

19、itor increases serum prostate specific 49antigen concentration while suppressing growth of humanprostate cancer xenografts in nude mice J . Nutr Cancer，1999 ,33 （2） :174-177.3Stonelake PS, Jones CE, Neoptolenos JP etal, Proteinase inhibitors reduce basement membrane degradation by human breast cance

20、r cell linesJ. Br J Cancer,1997, 75(7): 951-959.4Kennedy AR. Chemopreventive agents : protease inhibitors J .Pharmacol Ther , 1998 ,78 (3) :197-209.5Ann R Kennedy.The Bowman-Birk inhibitor from soybeans as an anticarcinogenic agent1-3J.Am J Clin Nutr, 1998，68(suppl):1406-1412.6Zhang L , Wan XS, DonahueJJ , et al.Effectsof the Bowman Birk inhibitor on clonogenic survival and cisplatinor radiation induced cytotoxicity in human breast , cervical , and head and neck cancer cells J .Nutr Cancer,1999 ,33 2 :165-173.7杜惠芬，李克生，郭紅云，等.胰蛋白酶抑制劑體外抑制腫瘤細胞降解細胞外基質的研究J.