1、第三章：基因藥物體外表達的受體細胞第一節、宿主細胞選擇原則1 1、容易獲得較高濃度的細胞；、容易獲得較高濃度的細胞；2 2、安全，不致病；、安全，不致病；3 3、遺傳背景清楚，容易進行、遺傳背景清楚，容易進行dnadna重組操作及遺傳改造；重組操作及遺傳改造；4 4、產物的產量高、產物的產量高（表達水平和穩定性）（表達水平和穩定性） 、生物活性高生物活性高5、產物容易提取純化。產物容易提取純化。6 6、容易進行代謝調控；、容易進行代謝調控；7 7、易培養（生長速度、營養需求、氧耗量等），培養成本、易培養（生長速度、營養需求、氧耗量等），培養成本低低第二節、宿主細胞分類及特點n分類：原核細胞（原

2、核細胞（大腸桿菌、枯草芽胞大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等）桿菌、鏈霉菌等）n 真核細胞真核細胞（酵母細胞、哺乳動物（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞）細胞、昆蟲細胞）一、原核表達系統的特點一、原核表達系統的特點n（一）優點：（一）優點：1、 結構簡單，基因組成及功能相對清楚，易于遺傳操作及轉化2、生理代謝途徑及表達調控機制相對清楚，便于表達調控3、生長迅速，要求條件低（大腸桿菌倍增時間為17分鐘），易于大規模培養。（二）缺點（二）缺點1、不能識別剪切內含子，不能表達基因組dna，只能表達cdna；2、缺乏真核生物的蛋白質加工修飾系統，不能進行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、酰胺化等

3、修飾作用； 蛋白酶解作用：從蛋白前體中切去一段氨基酸序列，從而獲得功能性分子 糖基化意義： 賦予蛋白獨特的結合性并增強穩定性3、不具備真核生物的蛋白質復性系統（如蛋白二硫鍵異構酶），不能進行真核蛋白的正確折疊；二、酵母（yeast）表達體系特點n酵母菌是最簡單的真核單細胞生物；n是外源真核基因最理想的表達體系。（一）優點：（一）優點： 1、全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便2、具有原核生物無法比擬的蛋白翻譯后加工修飾系統。對表達的蛋白可進行正確折疊和糖基化、磷酸化等修飾； 3、安全：不含特異病毒、不產生毒素，美國fda認定為安全的4、繁殖迅速（倍增期約2小時 ），要求條件低，

4、大規模發酵工藝簡單，成本低廉； 5、能外分泌（二）缺點：1、生長相對細菌緩慢2、對有些生物活性蛋白仍無法表達或正確修飾，比如蛋白超糖基化 超糖基化修飾作用n酵母菌糖蛋白的n糖基外鏈的組成成分只有甘露糖，但其分支結構極為復雜的的現象稱為超糖基化修飾作用。 酵母菌 高等真核生物o寡聚多糖鏈 甘露糖單體 唾液酸基團n糖基外側鏈 甘露糖 甘露糖 n乙酰葡萄糖胺 半乳糖 果糖 唾液酸等 n-連接糖基化(n-linked glycosylation)n新合成蛋白進行糖基化修飾的一種方式。n糖通過與蛋白質的天冬氨酸的自由nh2基連接，所以將這種糖基化稱為n-連接的糖基化。o-連接的糖基化（o-linked

5、glycosylation）n高爾基體中進行的另一種蛋白質的糖基化，將糖鏈轉移到多肽鏈的絲氨酸、蘇氨酸或羥賴氨酸的羥基的氧原子上。三、哺乳動物細胞表達特點哺乳動物細胞表達特點n是表達哺乳動物基因（如人基因）的最好受體細胞。n優點：1、能識別和剪切內含子并加工為成熟的mrna，既可表達cdna又可表達基因組dna；2、表達產物具有正確地高級結構和糖基化、磷酸化等修飾。3 3、表達產物可分泌到培養液中，純化容易。缺點：缺點：1、細胞生長慢，培養條件刻苛，大規模培養工藝復雜、費用高2、培養液中產物濃度較小3、轉化細胞篩選麻煩 主要基因工程表達體系比較主要基因工程表達體系比較表達體系表達體系 產產 物

6、物 產生部位產生部位 培養方式培養方式 提提 純純 產物活性產物活性 潛在危性潛在危性大腸桿菌大腸桿菌 多肽蛋白質多肽蛋白質 菌體內菌體內 容易容易 一般一般 對原核好對原核好 不大不大 融合蛋白質融合蛋白質 部分高產部分高產 對真核差對真核差 酵酵 母母 多肽蛋白質多肽蛋白質 菌體內菌體內 容易容易 菌體內菌體內 真核的接近真核的接近 不大不大 糖基化蛋白糖基化蛋白 外分泌外分泌 可高產可高產 稍復雜稍復雜 天然產物天然產物 哺乳動物哺乳動物 完完 整整 外分泌外分泌 較難成本高較難成本高 簡單簡單 可達天然可達天然 需注意需注意 糖基化蛋白糖基化蛋白 可高產可高產 產物產物 致癌致癌第三節

7、、常用原核表達細胞n大腸桿菌n枯草芽孢桿菌n短小芽孢桿菌一、大腸桿菌表達體系（一）生物學特性n革蘭氏陰性桿菌n大小24um0.40.1um；n無芽孢；n一般無莢膜(capsule)n裂殖(fission)分裂，3717分鐘繁殖一代。（二）特點n優點： 1、載體受體系統完備2 2、外源基因表達水平高，可達總蛋白530；3、下游技術成熟缺點：1、 胞內表達蛋白易形成無活性的包涵體，需進行復性操作；可溶性表達的胞內真核蛋白易被細菌蛋白酶水解2、蛋白分泌機制不健全，外源真核基因很難實現分泌表達，且分泌產物大多只能分泌到細胞周質（細胞質與外膜之見的間隙）；少數分泌表達的蛋白表達效率比包含體形式低很多。3

8、、胞內表達產物蛋白質產物蛋白質n n端多余一個甲硫氨酸殘基端多余一個甲硫氨酸殘基（由起始（由起始密碼密碼atg編碼），影響活性或容易引起免疫反應編碼），影響活性或容易引起免疫反應 4、 細胞壁含脂多糖（內毒素），增加了分離純化難度包涵體n細胞內由生物大分子致密聚集形成的被膜包裹或無膜的水不溶顆粒狀物（相差顯微鏡或電子顯微鏡下可見）。組成：1、外源重組蛋白：50以上2、宿主蛋白：rna聚合酶、核糖核蛋白體、外膜蛋白等3、質粒編碼蛋白：如標記基因產物4、非蛋白分子：dna、rna、脂多糖等蛋白特點：氨基酸序列組成正確，空間構象往往錯誤（三）在基因工程中的應用n擴增外源擴增外源dna（雙鏈、單鏈）（

9、雙鏈、單鏈）n構建基因文庫（構建基因文庫（dna文庫、文庫、cdna文庫）文庫）n高效表達原核生物基因高效表達原核生物基因n表達不需翻譯后加工、修飾的真核蛋白表達不需翻譯后加工、修飾的真核蛋白五、實驗室常用的大腸桿菌五、實驗室常用的大腸桿菌n用于接受質粒：用于接受質粒：c600w3110hb101jm83 jm101（aps、tcs、cms）n用于接受用于接受l l-dna：le392、ed8654 二、芽孢桿菌（bacillus subtilis）表達體系（一）生物學特性n革蘭氏陽性桿菌n大小0.70.823mn能產生芽孢；（二）特點n優點：1、具有高效分泌機制，可將表達的外源蛋白高效分泌到

10、培養基中，且多數真核蛋白經芽孢桿菌分泌后便具有天然構象和生物活性2、胞壁不含脂多糖，不產生內毒素缺點1、載體受體系統不完備載體受體系統不完備2、常規方法、常規方法不易轉化不易轉化3、野生型芽孢桿菌合成和、野生型芽孢桿菌合成和分泌大量的胞外蛋白酶分泌大量的胞外蛋白酶，直接影響表達產物的穩定性直接影響表達產物的穩定性4、發酵技術不如大腸桿菌成熟發酵技術不如大腸桿菌成熟（三）基因制藥目前普遍使用的芽孢菌表達系統及載體n枯草芽孢桿菌：蛋白分泌能力強，但同時至少分泌6種蛋白酶n短小芽孢桿菌：蛋白分泌能力與枯草芽孢桿菌接近，但胞外蛋白酶活性遠低于枯草芽孢桿菌，且可分泌蛋白酶抑制劑多重蛋白酶基因缺陷枯草芽孢

11、桿菌受體菌ndb428wb500 wb600 db428、wb500 、wb600蛋白酶活性分別只及野生型的3.1、0.8、0.3，若加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（pmsf）則wb600胞外檢測不到蛋白酶活性。兩株胞外蛋白分泌水平較高的短小芽孢桿菌野生株n芽孢桿菌47株nhpd31株 在合適培養條件下，每升培養液可積累30g蛋白產物芽孢桿菌使用的表達載體npnu210npyqlnpub18（四）在基因工程制藥中的應用n重組蛋白多肽藥物的分泌表達重組蛋白多肽藥物的分泌表達白細胞介素2白細胞介素3表皮生長因子（egf）人干擾素乙肝病毒核心抗原第四節、基因制藥常用酵母表達細胞n釀酒酵母（saccha

12、romyces cerevisiae）n巴斯德畢赤酵母（pichia pastoris)）n乳酸克魯維酵母（kluyveromyces lactis）n多型漢遜酵母（hansenula polymorpha）一、釀酒酵母n是第一個用于基因藥物表達的酵母菌，遺傳背景已相當清楚：有17條染色體，1996年完成其全基因組測序，基因組為12068 kb，閱讀開放開架5887個，編碼約6000個基因，比單細胞的原核生物和古細菌大一個數量級。n受體細胞舉例：釀酒酵母grf18應用n1981年釀酒酵母表達了 第一個外源基因一干擾素基因，隨后又有一系列外源基因在該系統得到表達。 nfda批準的第一個基因工程疫

13、苗就是釀酒酵母表達的乙肝疫苗（merck公司）n上市產品還有人胰島素（丹麥novo nordisk公司）和人粒細胞集落刺激因子（immunex公司）等 存在問題1、外源基因表達水平不高。原因：（1）密碼子使用的偏向性（trna與外源基因密碼子不匹配）（2）乙醇發酵途徑活躍導致生物大分子合成普遍受到抑制（3）質粒的不穩定性2、重組異源蛋白超糖基化修飾二、巴斯德畢赤酵母（pichia pastoris）n是近年來發 展最為迅速，應用最為廣泛的酵母細胞。n是一種甲基營養菌，能在相對較為廉價的甲醇培養基中生長。優點n除具有一般酵母所具有的特點 外，還有以下幾個優點：1、具有目前最強，調控機理最嚴格的啟

14、動子之一 乙醇氧化酶乙醇氧化酶aox1基因啟動子基因啟動子,外源蛋白表達量高（一般 500-4000mg/l，最高為破傷風毒素c達到12g/l） 。 2、表達質粒能在基因組的特定位點穩定整合。 3、蛋白產物糖基化修飾作用大多數情況下接近哺乳動物細胞且可直接以天然可溶形式分泌到胞外。缺點n發酵周期長，要添加甲醇n分子生物學基礎不清楚，遺傳改造難度大。應用 生產重組真核藥物蛋白： 近年來，invitrogon公司開發了畢赤酵母表達系統的系列產品，短短幾年已經有300多種外源蛋自在該系統得到有效表達，被認為是目前最有效的酵母表達系統。 藥物蛋白已有20多種，見 李元基因工程藥物p52表。如人il2、

15、人血清白蛋白、tnf、hbsag、egf、破傷風毒素c片斷、人巨細胞病毒抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物等，有些即將進入市 場。常用畢氏酵母菌 nkm71和gs115:都具有his4營養缺陷標記。 gs115茵株：具有aox1基因，是mut，即甲醇利用 正常型； km71菌株：aox1位點被arg4基因插入，表型為muts，即甲醇利用緩慢型 共同特點:為組氨醇脫氫酶缺陷株，與帶有his標記基因的表達質粒配合使用三、乳酸克魯維酵母n具有可穩定存在的附加體型質粒pkd1載體及高拷貝整合型質粒pmirk1n外源基因表達水平比釀酒酵母高，如由重組乳酸克魯維酵母合成的人il1是重組釀酒酵母的80100倍。四

16、、多型漢遜酵母表達系統n蛋白糖基化修飾作用接近哺乳動物細胞。n也是一種甲基營養菌。舉例：利用重組酵母生產乙肝疫苗n第一代乙肝疫苗：病毒攜帶者體內提取n存在問題：1、來源有限2、提取過程復雜3、致病潛在危險4、成本高第二代乙肝疫苗重組乙肝疫苗n第一階段：大腸桿菌重組乙肝疫苗。20世紀70年代末嘗試用大腸桿菌表達乙肝表面抗原hbsag，但表達水平極低n第二階段：釀酒酵母重組乙肝疫苗。起始于20世紀80年代初，將hbshg（或s多肽）的編碼序列置于adh1（釀酒酵母的乙醇脫氫酶1基因）啟動子或pgk（磷酸甘油酯激酶基因）啟動子后面，表達出具有免疫活性的非糖基化hbshg 。目前已作為乙肝疫苗商品化，

17、商品名為recombivaxb或engerixb。第三階段：巴斯德畢赤酵母重組乙肝疫苗nhbsag基因穩定整合在巴斯德畢赤酵母染色體上n表達產物量比在釀酒酵母中高1倍，并且表達蛋白效價高出釀酒酵母數十倍。第五節、常用哺乳動物表達細胞n能在培養基中無限生長的哺乳動物細胞系。n一般為與正常細胞生理特性基本接近、無平面接觸抑制特性的腫瘤細胞系或異倍體連續細胞系 有限細胞系和無限細胞系n有限細胞系（finite cell line）：正常細胞經過多次傳代后，一般可連續培養3050代，就會逐漸失去增殖能力，也就是說它們只能生長有限的時間，經過若干傳代培養后將老化死 亡，把這類細胞稱為有限細胞系。n無限細

18、胞系（infinite cell line）或連續細胞系（continuous cell line）：當細胞經過自然或人為的因素轉化為異倍體后，能變為無限細胞系，沒有分裂次數的限制。藥物生產應用的主要細胞系n非洲綠猴腎細胞（cos）、中國倉鼠卵巢細胞（cho ）、小倉鼠腎細胞（bhk）、人胚胎腎細胞（hek239）、 c127 n用于基因瞬時表達： cos、 bhk、 hek239n用于基因穩定表達：cho一、cho細胞（ chinese hamster ovary cells）（一）一般特性：n分離自中國倉鼠卵巢（chinese hamster ovary，cho）n上皮樣細胞，貼壁生長型n

19、對水泡性口炎和getah病毒敏感。細胞貼壁培養和懸浮培養 n （二）優點（二）優點1、外源基因整合到宿主細胞后能穩定保持；2、可分泌表達外源蛋白，而內源蛋白分泌很少。3、蛋 白質翻譯后的修飾準確，表達產物的結構、性質和生物活性接近天然。4、培養條件要求低。對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力；能在無血清的條件生長。（三）應用n有多個衍生突變株應用于藥物的生產，培養時需要添加脯氨酸。n采用二氫葉酸還原酶 （dhfr）的缺陷株（*cho/dhfr）表達的藥物有人組織性纖溶酶原激活劑 tpa、 ifn、ifn 、epo、hbsag疫苗、g-csf、凝血因子等已投放市場。n可在在氨甲酰喋呤 （methot

20、rexate,mtx）存在下，增加外源基因的拷貝數，提高蛋白的表達水平，使外源基因高效表達。二、bhk細胞（一）一般特性： 分離自幼倉鼠的腎臟（baby hamster kidney, bhk） 成纖維樣細胞，非整倍體，2n=44。（二）應用：用于增殖病毒制備疫苗和重組蛋白。 兩種重組凝血因子，bayer的kogenate fs、aventis behring的helixate分別于1989和1994被fda獲準上市，1999年fda批準novo nordisk的重組凝血因子viia（novoseven）上市，用于治療血友病。三、c127細胞（一）一般特性： 分離自小鼠乳腺腫瘤 上皮樣細胞，貼壁型生長。 被牛乳頭瘤病毒（bovine polyoma virus，bpv）dna載體轉染后，細胞形態發生明顯變化。 （二）常用細胞系： c127：lt細胞系：生長密度