1、山 東 中 醫 藥 大 學教 案 首 頁教研室主任：呂青濤授 課 人：呂青濤 研究生(部) 2011 年級 中藥 專業 班 2011 年 9 月 20日題 目:熒光分析法教學目的與要求:（1）掌握分子熒光、磷光和化學發光的產生機理；掌握激發光譜和發射光譜特征。（2）掌握熒光與分子結構的關系以及溶液的熒光（磷光）強度影響因素。（3）熟悉熒光（磷光）分析法的特點及定量測定方法。（4）了解磷光分析法的類型。（5）熟悉熒光、磷光和化學發光分析儀器的結構。內容與時間分配: 熒光分析原理：120min； 熒光儀器：20min； 分析方法：40min； 磷光分析簡介：20min；重點與難點:1、熒光的產生；

2、2、熒光光譜與激發光譜；3、熒光與分子結構4、影響因素5、分析方法教具準備:PPT教 案 內 文熒光分析法（fluorometry）靈敏度高，紫外可見法107g/ml待測物質：分子熒光 原子熒光激發光： 紫外可見熒光 紅外可見熒光X射線熒光1、基本原理利用目一波長得光照射試樣，使試樣吸收這一輻射，然后再發射出波長相同或較長得光，若這種再發射約在10-9秒內發生，稱為熒光，利用熒光得強度和特性對物質進行定性、定量分析，稱為熒光分析法。當分子軌道中電子吸收光子躍遷，若電子躍遷后，處于自旋方向相反得狀態，則總自旋量子數S0，體系的多重性M=2S+1，既為激發態的單線態（此分子在磁場中不產生能級裂分）

3、若電子躍遷后，處于自旋方向相同的狀態，則總自旋量子數S=1/2+1/2=1,體系的多重性M=2S+1=3,即為三線態（在磁場中，三線態的電子能級產生裂分，一條線可分裂成三條線。三線態的能量較相應單線態的能量低）。電子由單單躍遷，所需E1<E2(單三) 由于單三的躍遷使禁阻的，所以摩爾吸光系數小分子在室溫基本處于電子躍遷的級態，吸收了可見紫外光后，基態分子只能躍遷到激發單線態的各個不同振轉能階，而不能直接躍遷到激發三線態的各個振轉能級（自旋禁阻定律）。紫外可見光照射物質，基態分子不斷躍遷到激發態，則分子的紫外吸收應逐漸減小至消失，但事實上物質分子能夠連續吸收紫外可見光，說明存在一條或多條從

4、分子激發態往基態的途徑。振動弛豫：無輻射躍遷，只在同一電子能級內進行。激發態分子由于分子間碰撞或分子與晶格間的相互作用，以熱的形式損失掉部分能量，從振動能級的較高能級下降。既激發態不同振動能級間的能量釋放，這部分能量以熱的形式釋放，而不是以光輻射的形式發出，故振動弛豫屬于無輻射躍遷。熒光發射電子由激發態的最低振動能級回遷到基態，釋放出能量，發射的光為熒光。由于已損失了部分能量，所以熒光的波長<原照射的紫外光波長。內部能量轉換：非輻射過程激發態分子將激發態能轉變為熱能，回到基態。第二電子激發態S2的的振動能級與第一電子激發態的高振能級的E較小，甚至重疊，所以，他們之間的內部能量轉換很容易發

5、生，速度很快。因此，分子無論在哪一個激發單線態都能通過內部能量轉換到達低一級激發態的最高振動能級；然后通過振動弛豫回到起最低振動能級；最終回到基態的最低振動能級。這一過程成為內部卒滅。大多數物質的內部卒滅過程很快，所以無熒光發出。內部能量轉換激發態分子通過碰撞將能量轉移給其他分子，直接回到基態，導致外部卒滅。例：溶劑中含熒光卒滅劑或溫度較高時，易產生外部卒滅。體系間交叉躍遷電子由激發單線的最低振動能級激發三線態的最高振動多數分子：體系間交叉躍遷時禁阻的。極少數分子可以（如含溴、碘等重原子）因為其自旋軌道的強偶合作用，電子自旋可以逆轉方向，時體系跨越容易。磷光發射電子通過振動弛豫從激發態三線態的

6、最高振動最低，然后發出光發射躍遷至基態的各個振動能級，這種光輻射稱磷光發射。激發三線態最低振動能級低于單線態所以磷光輻射能量<熒光磷光輻射波長>熒光熒光法不普及：室溫下難呈現體系間跨越幾率小體系間跨越后，又一改體系間跨躍回到激發單線態熒光分子間碰撞，溶劑間作用，各種卒滅效應。所以，磷光法：液氮冷凍條件下激發。延遲熒光分子在激發三線態的振動基態可以存活一定時間，所以需時較長。2、激發光譜與熒光光譜熒光時分子受激發射光譜，所以有兩個特征光譜：激發光譜 發射光譜（1） 激發光譜：以激發光波長為橫坐標 熒光強度為縱坐標熒光強度隨激發光波長的變化（2） 熒光光譜：以熒光的發射波長為橫坐標 熒

7、光的發光強度為縱坐標熒光物質的ex,man和em,max是鑒定的依據，也是定量的依據，（3） 特點：（4） 紫外光譜：紫外光的吸收度熒光物質的激發光譜兩者相似，因吸收了紫外線才能發射熒光激發光譜與紫外吸收相似，但不完全重疊熒光光譜與激發光譜相比在長波長處熒光光譜的吸收峰只有一個，且與激發光波長無關。激發光譜與熒光光譜呈鏡像關系，例蒽的激發光譜與熒光光譜（在高分辨的熒光光譜圖上）激發光譜 a峰：分子基態S0S2* b峰：分子基態S0Si*的（V0、V1、V2、V3、V41、2、為不同的能級）b0峰相當于b0的躍遷線 b1峰相當于b1的躍遷線熒光光譜：C峰：分子從第一電子激發態的振動能級基態躍遷至

8、電子基態的不同振動能級而形成C0峰C0躍遷線C1峰C1的躍遷線3、熒光與分子結構的關系(1) 產生過程:(2) 分子吸收光子，由基態第一電子激發態或第二激發態通過無輻射躍遷回到第一激發態的最低振動能級躍遷到基態的各振動能級發出熒光通過無輻射躍遷回到基態的最低振動能級（2）產生熒光的必要條件分子吸收光能量（紫外可見吸收強），產生躍遷。（n×躍遷弱，所以引起的熒光極弱）吸收后必須具有較高的熒光效率，才能產生熒光物質分子不是吸收熒光紫外光量子，即能夠發射一個熒光量子。物質發射熒光的量子數與所吸收的激發態量子數的比值，稱為熒光效率或熒光量子產率f發出熒光的量子數/吸收激發光的量子數（3） 熒

9、光強度與分子結構的關系（內部因素）長共軛結構×躍遷產生強K帶紫外吸收。電子共軛越長，ex和en將長移。F、f將增大分子的剛性結構和共平面效應分子的剛性結構和共平面效應增大，f增大，且em長移。例：取代基a、 增加分子的電子共軛程度，f增大，em長移的基團NH2,OH,OCH3,NHR,NR2,CN等b、 減弱分子的電子共軛程度，f減小，甚至熒光卒滅的基團COOH,NO2,C=O,NO,SH,NHCONH3,F,Cl，I,-Br等c、 對分子的電子共軛作用小，對熒光影響不明顯。R,SO3H,NH3+等4、影響熒光強度的外部因素（1） 溫度：溫度增大，f小，碰撞幾率大，分子運動速度增大，

10、無輻射躍遷增大， （2） 溶劑：a,極性大，f大。紅移所以極性溶劑中，E×減小。 b、粘度大，f大，粘度小，分子碰撞幾率增大，所以f小（3）PH值的影響：對弱酸和弱堿的熒光物質影響大。PH值不同，離子電離結構不同。如：（4） 熒光熄滅劑：使f減小或熒光強度與濃度不呈線性關系。常見的熄滅劑有：鹵素離子、重金屬離子，氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基混合物。原因：分子碰撞；產生無熒光的配合物；I、Br溶解O2使易發生體系跨越至三線態；（5） 散射光干擾a、 容器表面：方形影響小，原形影響大。 可通過調整狹縫減小散射。b、 丁達爾散射：膠體顆粒產生的散射可盡量除去膠體顆粒；脫氣c、

11、 瑞利散射：瑞利光波長激發光波長 分子吸收光子后，由基態較低振能級較高能級，并在極短的時間內返回原來的能級，釋放出與激發光相同波長的光線。d、 拉曼散射分子吸收光子，基態較低振動能級較高能級回到稍高或稍低與原能級的振動能級。拉曼光波長激發光波長可通過減小狹縫加強濾光片選擇激發波長來減小拉曼光的干擾。（6） 氫鍵的影響與溶劑或其它溶液分子產生氫鍵，對熒光光譜和熒光強度有顯著的影響（7） 表示活性劑的影響增溶、增穩、表面活性劑濃度增大膠束對熒光分子有遮蔽作用。減小分子碰撞幾率保護激發單線態熒光分子提高f（8） 自卒滅熒光物質濃度過大，>1g/l產生的熒光含被分子吸收。使熒光強度減小，發生濃度

12、卒滅5、熒光強度與濃度的關系（1） 定量關系F（I0-It）F:熒光強度。（I0-It）：被吸收的光強度即F=（I0-It）.KK常數，取決于f根據Beer定律：IT/I0=10-Ecl即：F= KI0(1-10-Ecl)= KI0(1-e-2.3Ecl)= KI02.3Ecl-(-2.3Ecl)/2!-(-2.3Ecl)2/3!-(-2.3Ecl)n/n!當Ecl時，即稀溶液F=K´I02.3Elc=KC所以，濃度低時，F與C成線性關系。（2） 靈敏度高 可通過放大檢測信號，增加激發光強度，通過靈敏度。而吸收光譜：A-lgIt/I0It/I0為比值，無法放大（3） 定性、定量分析定

13、性分析：依據激發光譜中地峰位鑒定物質。注意：影響因素多，測到地只是表觀光譜圖，須校正。一般用對照品對照定量分析方法：工作曲線法 比例法（標準曲線過原點）Fs-F0=KCsF樣-F0=KC樣 F0:空白溶液熒光強度 多組分測定：與紫外分光光度法定量分析用6熒光分光光度計（1） 主要部件激發光源：疝燈（多用）:連續光源汞燈：發射線光譜，產生不連續地一定波長地光另外：氘燈、鹵鎢燈等單色器：激發單色器（光源與樣品之間） 發射單色器(樣品與監測器之間)熒光計：慮光片熒光分光光度計：光柵作色散元件吸收池：石英檢測器：光電倍增管 光電二極管陣列檢測器：迅速、瞬時測定熒光光譜（2） 類型熒光計熒光分光光度計（

14、3） 校正（4） 波長校正用汞燈地標準譜線對單色器地波長刻度進行校正靈敏度：影響因素較多a光源強度穩定度單色器地性能b波長、狹縫c空白溶液、拉曼散射、激發光、雜質熒光常用：硫酸奎寧溶液作為標準溶液進行校正 光譜校正雙光束熒光分光光度計，參比光束抵消光學誤差7熒光分析新技術（1） 激發熒光分析：光源:激光、波長純，強度大檢測靈敏度高，樣品量<1ul最小可測10-16g測量生化樣品、氣體樣品及有機化合物中地自由基（2）同步熒光分析 靈敏度高在熒光物質地激發光譜和發射光譜中選擇適宜地波長差值，同時掃描熒光發射波長和激發波長，得同步熒光光譜。Fsp(em,ex)=KCFexFem(3) 膠束增溶

15、增敏熒光分析加入增溶增敏試劑，如表面活性劑：SDS,CTMAB,CPB,PVA,Triton*100等環糊精：CD，CD,-CD等表面活性劑在臨界膠束濃度時，相差疏水基向里，親水基向外得具有一定大小內腔得膠束，增溶、增敏其用于熒光分析，不僅提高了靈敏度、選擇性且可在分子水平模擬生物體系細胞膜結構。對藥物在體內的分布和作用機理進行研究。（4） 反相膠束增敏熒光分析法形成親水基向里，疏水基向外的微囊今年來在膜的模擬化學、蛋白質液液萃取，膠束催化，超細納米材料制備，有毒物質降解、醫藥、化工等領域有重要應用。（5） 時間分辨熒光分析根據分子熒光壽命不同，在激發與檢測之間間隔一定時間，使不同分子達到分別檢測，從而可以消除共存組分的干擾。 將其用于免疫分析，“時間分