1、細胞總細胞總RNA的提取的提取2015-07-21 1、mRNA: 1-5% 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亞基大亞基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亞基小亞基40S: 18S=1874nt ：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實驗器材表面。：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實驗器材表面。 生物活性非常穩定：耐熱、耐酸、耐堿。生物活性非常穩定：耐熱、耐酸、耐堿。 1、 盡量避免盡量避免源性源性RNase 污染污染 A. 操作環境空氣潔凈。帶手套、口罩。操作環境空氣潔凈。帶手套、口罩。 B. 用新開封的化學試劑。（試劑應該專用）用新開封

2、的化學試劑。（試劑應該專用） C. 一次性塑料器材最好是新開封，一次性塑料器材最好是新開封， (DEPC水處理后）高壓滅菌。水處理后）高壓滅菌。 D. 玻璃器材、水都應該經過去玻璃器材、水都應該經過去RNase 處理。處理。 對玻璃器材還應該進行高溫烘烤。對玻璃器材還應該進行高溫烘烤。 2、抑制、抑制源性源性RNase 活性：活性： RNase 抑制劑抑制劑。 1) 1) 樣品處理：樣品處理： （）培養細胞：收獲細胞（）培養細胞：收獲細胞 1-5 1-510 7 10 7 ，移入，移入 1.5ml 1.5ml 離心管中，加入離心管中，加入 1ml Trizol 1ml Trizol ，混勻，混

3、勻，室溫靜置室溫靜置 1010min min 。 （）組織：取（）組織：取 50-100mg 50-100mg 組織（新鮮或組織（新鮮或 -70 -70 及液氮中保存的組織均可）置及液氮中保存的組織均可）置 1.5ml 1.5ml 離心離心管中，加入管中，加入 1ml Trizol 1ml Trizol 充分勻漿，室溫靜置充分勻漿，室溫靜置1010 min min 。2 2) )加入加入200 200 l l， 震蕩混勻震蕩混勻20-30s20-30s，室溫放置室溫放置5min5min（此期間液體開始（此期間液體開始，此時不要輕易攪動液體此時不要輕易攪動液體）。）。3 3)10000 rpm)

4、10000 rpm，離心，離心5min5min。RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein4 4) ) 將清澈透明的將清澈透明的 轉移至另一離心管中。轉移至另一離心管中。5 5) ) 沉淀沉淀RNARNA： 加入加入0.5ml0.5ml，上下顛倒混勻，室溫放置，上下顛倒混勻，室溫放置10min10min。 10000rpm 10000rpm，離心，離心10min10min。棄上清。棄上清。6 6) ) 加加1ml1ml 洗滌管壁。洗滌管壁。 ( (注意貼管壁在沉淀的對側緩慢加入，不要攪動沉淀注意貼管壁在沉淀的對側緩慢加入，不要攪動沉淀) )7 7) 7500rpm) 7500rpm離心離

5、心1min1min，棄上清。，棄上清。 再離心幾秒鐘，將管壁液體（用加樣器）完全移凈。再離心幾秒鐘，將管壁液體（用加樣器）完全移凈。用用TriZol試劑提取總試劑提取總RNA時，全程均在時，全程均在室溫室溫進行。進行。當當RNA沉淀用水溶解后，應該注意在沉淀用水溶解后，應該注意在冰上冰上操作，操作要迅速。操作，操作要迅速。8 8) )室溫干燥室溫干燥3 35min5min。 （干燥的時間由（干燥的時間由RNARNA沉淀大小決定）沉淀大小決定） （干燥后的沉淀應該是（干燥后的沉淀應該是，沉淀要充沉淀要充分干燥但避免過分干燥，此步驟非常關鍵分干燥但避免過分干燥，此步驟非常關鍵）注意事項注意事項：R

6、NA:避免放在避免放在37 C孵箱中過度干燥以防無孵箱中過度干燥以防無法溶解。法溶解。RNA沉淀必須絕對干燥，微量乙醇殘留，沉淀必須絕對干燥，微量乙醇殘留，容易造成容易造成RT的失敗，但過分干燥又是造成的失敗，但過分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因不溶解的主要原因 。判斷判斷RNA沉淀是否充分干燥但又不是過沉淀是否充分干燥但又不是過分干燥是逆轉錄成功的關鍵環節。分干燥是逆轉錄成功的關鍵環節。RNA pellet：透明膠樣：透明膠樣干燥后應該無色透明干燥后應該無色透明9 9） RNA RNA的溶解：用加樣器吸取冰冷的溶解：用加樣器吸取冰冷DEPC-HDEPC-H2 2O O 20-3020-3

7、0 l l，加到，加到RNARNA上，反復吹打溶解上，反復吹打溶解RNARNA沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNARNA應置冰上保存應置冰上保存。1010) ) 吸出吸出 2-32-3 l l溶液放到冰上備用溶液放到冰上備用( (將用于將用于電泳電泳) )。1111) ) 剩余溶液放到冰上備用剩余溶液放到冰上備用 （將用于（將用于RTRTPCRPCR）。）。v注意：注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心沉淀的溶解一定要耐心充分，充分，一定一定要用加樣器要用加樣器反復反復多次吹打方多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出可。但由于溶液體積非常小，要避免出現氣泡影響現氣泡影響RNA的溶解。的溶解。避免氣

8、泡的方法：避免氣泡的方法：用加樣器的第一擋用加樣器的第一擋每次吹打都不要打出氣體每次吹打都不要打出氣體判斷溶解程度：判斷溶解程度：吹打時液體流動不拐彎吹打時液體流動不拐彎為止。為止。 將將 RNA 進行進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 9 l RNA 樣品樣品 23 l 上樣液輕輕混勻，上樣液輕輕混勻， 上樣上樣 電泳電泳: 120伏，伏，1020分鐘分鐘 注意注意: 電泳槽的清潔及新的電泳液！電泳槽的清潔及新的電泳液！ 瓊脂糖凝膠要新鮮配制！瓊脂糖凝膠要新鮮配制！ 紫外透射儀觀察電泳結果紫外透射儀觀察電泳結果RNA電泳結果電泳結果 rRNA可以作為內部可以作為內部Marker分分子，

9、通過觀察子，通過觀察rRNA的兩條帶的兩條帶（28S和和18S）的比例，可以判）的比例，可以判斷所提取斷所提取mRNA是否存在降解。是否存在降解。 RNA電泳并不能判斷電泳并不能判斷mRNA是否提取成功，也不作為鑒定是否提取成功，也不作為鑒定RNA提取質量的常規方法，因提取質量的常規方法，因為為在電泳過程中在電泳過程中RNA可能發生可能發生降解降解。RNA純度的判斷 280、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、鹽濃度和蛋白等有機物的值 A260/A280 1.82.0 1.8表明有蛋白質、苯酚的污染 2.2表明RNA已經水解成單核酸 A260/A230 2.0 2.0表明酚鹽離子，硫氰

10、酸鹽或其他有機化合物污染免疫組化的原理及流程介紹免疫組化的原理及流程介紹2015-07-21 主要內容主要內容免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹一一. .免疫組化的原理免疫組化的原理二二. .免疫組化的基本流程免疫組化的基本流程三三. .免疫組化的結果分析免疫組化的結果分析免疫組化的原理免疫組化的原理 應用抗原與抗體特異性結合的原理，對組織或細應用抗原與抗體特異性結合的原理，對組織或細胞內的抗原進行原位定位、定性及定量檢測的技術。胞內的抗原進行原位定位、定性及定量檢測的技術。免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹直接法直接法Tissue AntigenLabeled Antib

11、odyq將熒光、酶直接標記在一抗上優點：q簡單方便缺點：q靈敏度低q每種一抗都需要進行標記 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹直接法直接法間接法間接法Tissue AntigenPrimary AntibodySecondary Antibodyr 將熒光、酶等標記在二抗上優點：r靈敏度高r只需要少數標記的二抗可以和相應的一抗反應 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹間接法間接法免疫組化SP法SPSP法法- -鏈霉素抗生物素蛋白鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物過氧化物酶法酶法 （streptavidin-peroxidase）l一抗一抗l生物素標記的二抗生物素標記的二抗lStre

12、ptavidin-HRPStreptavidin-HRP（HRPHRP標記的鏈霉親和素）標記的鏈霉親和素） 簡化實驗步驟 減少非特異性背景免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化SP法 ABC ABC法法 (Avidin Biotin-peroxidase Complex)l一抗一抗l生物素標記的二抗生物素標記的二抗lAvidin-Biotin-HRP ComplexAvidin-Biotin-HRP Complex（親和素（親和素-HRP-HRP標記的生物素）標記的生物素）v 親和素與HRP標記的生物素混合，放置30分鐘。v 一個親和素分子具有可與生物素結合的四個部位。v 大大增

13、加了結合到生物素上的過氧化物酶，提高了顯色反應的 靈敏度。免疫組化ABC法免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化ABC法三三 免疫組化的基本流程免疫組化的基本流程免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹1.1.脫蠟與水化脫蠟與水化2.細胞通透、封閉內源性過氧化物酶 3.3.抗原修復、暴抗原修復、暴露抗原決定簇露抗原決定簇 4.4.封閉非特異性封閉非特異性蛋白蛋白 5.5.一抗孵育一抗孵育 6.6.二抗孵育二抗孵育 7.SP 7.SP 反應反應 8.8.顯色顯色 9.9.復染、脫水、復染、脫水、透明、封片透明、封片 2.2.細胞通透、封細胞通透、封閉內源性過氧化閉內源性過氧化物

14、酶物酶 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹1.1.脫蠟與水化脫蠟與水化 脫蠟與水化的脫蠟與水化的目的目的是確保抗體等其是確保抗體等其他試劑能夠充分與組織中抗原等結合發他試劑能夠充分與組織中抗原等結合發生反應。若脫蠟和水化不全易出現局灶生反應。若脫蠟和水化不全易出現局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。景著色。 60 20 minXylene：2 10 minutes； 100% absolute ethanol： 2 5 minutes； 95% ethanol 2 minutes； 80% ethanol 2 minutes； 70% et

15、hanol 2 minutes； distilled water:5 min； PBS 洗 3 3 min。 具具體體操操作作免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹2.2.細胞通透與封閉內源性過氧化酶細胞通透與封閉內源性過氧化酶 目的是使抗體能夠充分地進入胞內目的是使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應。一般用進行結合反應。一般用Triton X-100Triton X-100、蛋白酶蛋白酶k k等通透液。等通透液。(1)(1)細胞通透細胞通透免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹(2)(2)封閉內源性過氧化酶封閉內源性過氧化酶 其主要目的是降低內源性過氧其主要目的是降低內源性過氧化

16、物酶的活性。在傳統的化物酶的活性。在傳統的ABCABC法和法和SPSP法中，免疫組化反應結果容易受到法中，免疫組化反應結果容易受到內源性過氧化物酶的干擾，必須用內源性過氧化物酶的干擾，必須用過氧化氫等進行滅活。過氧化氫等進行滅活。 1)1)用封閉通透液浸潤切片用封閉通透液浸潤切片 30 min 30 min（RT RT 避避光）。光）。 其配法是用預熱其配法是用預熱 40 ml PBS 40 ml PBS 加加120ul 120ul TritonX-100 TritonX-100 加熱幾分鐘，在臨用前加加熱幾分鐘，在臨用前加 400 ul400 ul的的3030H H2 2O O2 2。2)P

17、BS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹具體操作具體操作: :免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹3. 3. 抗原修復抗原修復 暴露抗原決定簇暴露抗原決定簇 由于組織中部分抗原在甲醛或多由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹

18、 常用的修復方法從強到弱一般常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。胰酶修復。 抗原修復的主要方法抗原修復的主要方法: :酶消化方法酶消化方法一般用于細一般用于細胞內抗原胞內抗原應用高頻電磁波應用高頻電磁波打開蛋白質間的打開蛋白質間的交聯鍵交聯鍵免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹將切片放入將切片放入 0.01 M 0.01 M 檸檬酸鈉緩沖檸檬酸鈉緩沖 溶液（溶液（pH6.0pH6.0）后，在微波爐里高火）后，在微波爐里高火 4 min 4 min 至沸騰后，取出，冷卻至室溫，至沸騰后，取出，冷卻至室溫，再加熱，約再加熱，約4

19、4次，每次間隔補足液體，次，每次間隔補足液體，防止干片。防止干片。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。具體操作（微波修復）：具體操作（微波修復）：1)免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹4.4.封閉特異性蛋白封閉特異性蛋白組織切片上有些組織切片上有些剩余剩余的位點可以與一的位點可以與一抗抗非特異性結合非特異性結合，造成后續結果的，造成后續結果的假假陽性陽性。封閉血清一般是和二抗同一來源的，血封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中有一些動物自身的抗體，預先能和清中有一些動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合。組織中有交叉反應的位點發生結

20、合。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹 將切片取出將切片取出, ,周圍水分用濾紙吸干周圍水分用濾紙吸干, ,用組化用組化筆在組織周圍畫上圈筆在組織周圍畫上圈, ,在圓圈內組織滴入在圓圈內組織滴入 5% 5%羊羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中, ,室溫室溫 ( (約約30)30)下下101030min30min。 具體操作：具體操作：大一點免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹5.5.一抗孵育一抗孵育一抗一抗: :可以特異結合底物，就是識別出可以特異結合底物，就是識別出我們想要檢測的東西。一抗和底物結我們想要檢測的東西。一抗和底物結合與否用

21、肉眼是看不出來的。合與否用肉眼是看不出來的。 一抗孵育條件在免疫組化反應中最重要，一抗孵育條件在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。包括孵育時間和抗體濃度。 一抗孵育溫度有幾種：一抗孵育溫度有幾種：4 4度、室溫、度、室溫、3737度，度，其中其中4 4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般體濃度有關，一般3737度度1-2h1-2h，然后，然后4 4度過夜和度過夜和從冰箱拿出后從冰箱拿出后3737度復溫度復溫45min45min。具體條件還要。具體條件還要摸索。摸索。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹1.防止脫片；防止脫片；

22、2.使抗原使抗原抗體結合更穩定。抗體結合更穩定。 甩去切片上的羊血清甩去切片上的羊血清, ,用濾紙擦干組織周用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1 1：250250、500500、10001000）后，放入濕盒中室溫）后，放入濕盒中室溫 1 1 小時，然后小時，然后 4 4 度過夜，冰箱中取出后需度過夜，冰箱中取出后需37 37 復溫復溫 45 min 45 min。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹具體做法：具體做法：免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹6.6.二抗孵育二抗孵育二抗二抗: :可以和一抗結合，并帶有可以被可以和

23、一抗結合，并帶有可以被檢測出的標記檢測出的標記( (如帶熒光、放射性、化如帶熒光、放射性、化學發光或顯色基團），作用是檢測一抗。學發光或顯色基團），作用是檢測一抗。 二抗孵育條件：二抗一般室溫或二抗孵育條件：二抗一般室溫或3737度度30min-1h30min-1h，具體時間需要摸索。，具體時間需要摸索。 但在免疫組化中我們一般先把二抗濃度但在免疫組化中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。孵育時間。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹 1) 1)將一抗倒掉并用將一抗倒掉并用 PBS PBS 洗洗 5 min 5 m

24、in5 5 次；次； 2) 2)用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入稀釋的二抗后放入 37 37恒溫烤箱中恒溫烤箱中 30 min。 3) 3)用用 PBS PBS 洗洗 5 5 次次5 min 5 min 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹具體操作：具體操作：7.SP7.SP反應反應 SP SP染色法即鏈霉素抗生物素蛋白染色法即鏈霉素抗生物素蛋白 生物素過氧化酶連接法。生物素過氧化酶連接法。 該法是該法是ABCABC法基礎上的進一步改良，法基礎上的進一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結合，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結合，而后再結合而

25、后再結合POPO基。基。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹1 1） 加入加入 SP SP 復合液后放入復合液后放入 37 37 度烤箱中度烤箱中 30 min。 2 2） 用用 PBS PBS 洗洗 5 次次5 min。具體操作：具體操作：SPSP染色法的特點染色法的特點: : 靈敏特異性低，成本低。靈敏特異性低，成本低。免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹8.8.顯色顯色 在免疫組化中，由于抗原抗體所在免疫組化中，由于抗原抗體所形成的復合物本身沒有顏色，不能形成的復合物本身沒有顏色，不能直接觀察，只能借助于其他某些化直接觀察，只能借助于其他某些化學基團的顯色作用，是復合物

26、顯色，學基團的顯色作用，是復合物顯色，有利于顯微鏡下觀察有利于顯微鏡下觀察。免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹 通常在過氧化物酶（通常在過氧化物酶（HRPHRP）法中，顯）法中，顯色劑為色劑為DABDAB。DAB(3,3-二氨基聯苯胺顯色液二氨基聯苯胺顯色液)配法配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹9 9、復染、脫水、透明、封片、復染、脫水、透明、封片 復染：目的是形成細胞輪廓，從而更復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，經常用的試劑好地對目標蛋白進行

27、定位，經常用的試劑為蘇木素。為蘇木素。 片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數秒（一定動作要快）后拿出流水酒精中數秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返藍即可。振洗，在放入氨水中返藍即可。 1) 1) 用用 PBS 3 PBS 3 次次3min 3min 后，用雙蒸水洗后，用雙蒸水洗 5 min 5 min；加；加一大滴蘇木素染液，（胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜一大滴蘇木素染液，（胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染蛋白染 20 s 20 s ），自來水沖洗，雙蒸水洗），自來水沖洗，雙蒸水洗 5 min 5 min，再，再用用 PBS PBS 返藍返藍

28、 5 min 5 min。 2) 2) 脫水脫水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 3) 3) 透明：透明：Xylene 1(1-2) minXylene 2(1-2) min 4) 4) 封片：中性樹膠。封片：中性樹膠。 免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹四四 免疫組化結果分析免疫組化結果分析免疫組化結果的判斷原則：免疫組化結果的判斷原則：1.必須設對照。必須設對照。2.抗原表達必須在特定部位。抗原表達必須在特定部位。3.陰性結果不能視為抗原不表達。陰性結果不能視為抗原不表達。免疫組化原理及流程介