1、學號00811047 內蒙古大學生命科學學院生物系基因工程實驗室本科基因工程大實驗開題報告論文題目： 納豆激酶基因表達載體的構建 及在大腸桿菌中的表達 學生姓名： 燕孟嬌 年 級： 2008 專 業： 生物技術 指導教師： 蘇慧敏 2011年 8 月7 日學生姓名張婷民族漢性別女出生年月1990年8月論文題目納豆激酶基因表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達開題時間2011年8 月1日結題時間2011年 8月7 日項目來源本科生基因工程大實驗課一、立論依據“納豆激酶基因表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達”項目的選題和研究的意義，國內外研究現狀及發展趨勢分析，主要參考文獻及出處：納豆激酶(natto

2、kinase簡稱NK)是一種枯草桿菌蛋白激酶，是在納豆發酵過程中由納豆枯草桿菌(Bacillus subtilisl natto)產生的一種絲氨酸蛋白酶。納豆激酶(NarroKunase，NK)由食品納豆中提取或納豆菌發酵生產，是一種分子量遠遠小于 UK、SK、tPA的蛋白質，并可由腸道，吸收，納豆激酶的體外、體內溶栓性質通過實驗也已得到確定，同時得出納豆激酶的體內溶栓活性為纖溶酶的四倍，在體內作用迅速、持續時間長，還能激活體內的tPA，使之溫和、持續地提高血液的纖溶活性。納豆激酶的物理、生化特點： 1)納豆激酶是在納豆發酵過程中由納豆枯草桿菌(Bacillus subtilisl natto

3、)產生的一種絲氨酸蛋白酶（單鏈多肽酶），分子量為27728道爾頓。 2)納豆激酶在溫度超過50時迅速變性失活，但反復凍融對其影響不大。 3)納豆激酶在PH值從7升至12時，10min內穩定；PH值低于5時，迅速變性失活。胃酸環境中的PH值只有1.2到2之間，納豆激酶根本無法通過。4)納豆激酶與粘性物質混合后，在PH值2-3的酸性環境中，還能保持不超過7.5%的活性。 5)納豆激酶是大分子的單鏈多肽酶，可被腸道消化液（糜蛋白酶、胰蛋白酶、小腸液等）分解成氨基酸片段或分子量更小的肽鏈。同其它生物活性物質一樣，納豆激酶的分秘表達受多種因素的影響。納豆激酶基因在體外轉錄有兩個啟動位點，之間被15個核苷

4、酸隔開；體內轉錄也在這兩個位點或其附近。下游位點(P：)具有一個獨特的d”識別序列。Moran等人對該基因的d”啟動子和其它兩種枯草芽孢桿菌的d”啟動子做了比較，比較了它們的保守堿基序列，在一35區P：啟動子的共有序列為5個堿基；在一10區共有序列為8個堿基兩區之間被15個堿基隔開。另外兩個堿基區可能調節該基因的表達一個是在啟動子上游35bp處的二分體對稱區，另外就是mRNA 上核糖體結臺位點，mRNA 上核糖體結臺位點序列為：pppAAAAG一0 0 A_0 00 U。 此外在納豆激酶基因的105-336bp處編碼了一段有77個氨基酸的蛋白肽(pmpeptide)，其有可能參與調節納豆激酶的

5、活性。納豆激酶的表達同其它枯草桿菌蛋白酶一樣受葡萄糖阻遏和被許多SpoO 孢子形成突變株阻斷，另外Cat A、hpr、Scoe突變株位點可以提高其表達。參考文獻1謝秋玲,孫奮勇,廖美德,張玲,汪炬. 納豆激酶原基因的克隆及表達J華南理工大學學報(自然科學版), 2002, (06).2 朱立成,張耀洲. 納豆激酶原核表達純化及多克隆抗體的制備J浙江大學學報(理學版), 2006, (04) .3 Hong-Bo Hu,Shan-Jing Yao,Le-He Mei,Zi-Qiang Zhu,Byung-Ki Hur. Partial purification of nattokinase fr

6、om Bacillus subtilis by expanded bed adsorptionJ Biotechnology Letters, 2000,22, (17) .4 付利，楊志興.納豆激酶的研究與應用J,生物工程進展.1995,15(15):46-49.5陳麗娟,沙長青,任永春等.納豆激酶溶解血栓機制J,中國生物工程雜志,2003,23(4):53-56.6 丁貴平,蔡正森,王正剛.納豆激酶的分離純化及生化研究J,氨基酸和生物資源,2001,23(3):13-16.7 閆達中，許芳，李潔.納豆激酶基因克隆及其在大腸桿菌中活性表達研究J,湖北大學學報（自然科學版）,2003,25(1

7、):69-72.8 NaKamura T, Yamagata Y, Ichishima E J. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN of Bacillus Subtilis(natto)J.Biosci Biotech Biochem,1992, 56(11):1869-1871.二、實驗方案1 實驗內容和實驗目標，擬解決的關鍵問題：1.1實驗內容：、PCR擴增NK。、將NK PCR產物與克隆載體pMD19-T連接成過渡質粒。、連接pET-trx與NK，構建表達載體pET-trx-NK。、轉化E. coli BL21(DE

8、3)，IPTG誘導表達、SDS-PAGE鑒定。1.2實驗目標：、學習基因工程的基本研究方法。、熟悉基因工程常規儀器的使用。、培養基因工程研究的嚴密邏輯和科學理念。、建立做好原始實驗記錄的習慣。1.3擬解決的關鍵問題：、PCR擴增NK。、過渡質粒以及表達載體的構建。、感受態細菌的轉化。、在E. coli BL21(DE3)中誘導表達NK。、SDS-PAGE檢測表達蛋白。2 實驗思路、方法、技術路線、實驗方案及可行性分析：2.1、實驗思路及方法：2.1.1、PCR擴增NKPCR引物： NK 上游 5-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3 BamH I NK 下游 5-GAAT

9、TCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3 EcoR I PCR產物大小：837bpPCR條件:94變性30s，60 退火30s，72 延伸30 s2.1.2、NK的亞克隆將NK PCR產物與pMD19-T連接過夜，構建pMD19-T-NK過渡質粒，然后將其轉入DH5感受態菌中。2.1.3、表達載體的構建EcoRI和BamHI雙酶切pMD19-T-NK過渡質粒和表達載體pET-trx，回收NK片段和pET-trx，連接pET-trx與NK，構建表達載體pET-trx-NK。2.1.4、誘導表達目的蛋白將pET-trx-NK轉化E. coli BL21(DE3)，IPTG誘導表達，并用

10、SDS-PAGE鑒定。2.2、技術路線提質粒pMD1-T-NK、pET-trx。PDU/PDLpMD19-TPCR擴增NKpET-trxpMD19-T-NKEcoRI和BamHINKpET-trx連接連接pET-trx-NKDH5a感受態菌pET-trx-NKBL21(DE3)感受態菌BL21(DE3)感受態菌IPTG誘導表達SDS-PAGE檢測3. 實驗進度（10天之內）：第一天下午：講解儀器，發放移液器等，滅菌（搖菌試管、培養皿），搖pET-trx、pMD18T-NK,配置培養基第二天上午：提質粒pET-trx、pMD18T-NK下午：PCR擴增NK，與pMD19-T連接過夜；倒平板，要D

11、H5第三天上午：作感受態DH5，EcoRI和BamHI雙酶切pET-trx下午：pMD19-T-NK連接液轉化DH5涂板；回收pET-trx第四天上午：七點挑pMD19-T-NK平板克隆，搖菌8-10h下午：七點提質粒pMD19-T-NK第五天上午：EcoRI和BamHI雙酶切pMD19-T-NK驗證；回收NK下午：NK與pET-trx連接過夜第六天上午：七點pET-trx-NK連接液轉化DH5，涂板下午：挑pET-trx-NK克隆，搖菌；搖BL21第七天上午：做感受態BL21,提質粒pET-trx-NK下午：Hind酶切驗證；轉化BL21，涂板過夜第八天上午：七點搖菌（包括空BL21）；練習

12、組裝SDS電泳模具下午：OD600=0.5時，誘導表達3h，離心集菌第九天上午：灌膠加樣電泳2-3h，染色45min,脫色下午：觀察脫色膠，轉入清水，照相4. 預期實驗成果：SDS-PAGE檢測蛋白表達可觀測到大小約為33-40KD的蛋白質大量表達。5. 曾參與與本實驗有關的學習和研究工作積累以及已取得的工作成績：（學過基因工程課程、讀過相關的文獻、寫過有關的綜述、參加過相關的實驗設計或研究課題、獲得過相關的學術獎勵情況等）曾學過基因工程等相關課程。6. 請運用已學過的課堂知識結合看過的有關研究文獻，提一個你認為適合本科生基因工程實驗課教學的基因工程大實驗方案DREB轉錄因子對干旱、高鹽和低鹽下逆境誘導基因表達起重要作用。本方案擬將DREB