1、www.CRTER.org周建國，等. 一氧化氮及一氧化氮合酶抑制劑對髓核細胞線粒體功能的影響一氧化氮及一氧化氮合酶抑制劑對髓核細胞線粒體功能的影響周建國1，楊 操2，熊蠡茗2(1贛州市人民醫(yī)院骨科，江西省贛州市 341000；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，湖北省武漢市 430022)引用本文：周建國，楊操，熊蠡茗*.一氧化氮及一氧化氮合酶抑制劑對髓核細胞線粒體功能的影響J.中國組織工程研究，2016，20(42):6278-6283.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.007 ORCID: 0000-0001-6651-2701(周建國)文

2、章快速閱讀：一氧化氮及一氧化氮合酶抑制劑煙酰胺影響兔髓核細胞線粒體功能的及其生物學(xué)行為周建國，男，1984年生，漢族，碩士, 主要從事椎間盤退變與創(chuàng)傷外科研究。通訊作者：熊蠡茗，博士, 副教授, 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，湖北省武漢市 430022中圖分類號:R318文獻標識碼:A文章編號:2095-4344(2016)42-06278-06稿件接受：2016-07-16檢測指標：(1)髓核細胞增殖活力；(2)細胞內(nèi)ATP濃度；(3)細胞內(nèi)活性氧水平；(4)細胞內(nèi)一氧化氮合酶活性；(5)髓核細胞線粒體膜電位。 正?？瞻讓φ战M10 mol/L 硝普鈉組100 mol/L硝普鈉組20

3、0 mol/L硝普鈉組0.05 g/L煙酰胺組(100 mol/L硝普鈉+0.05 g/L煙酰胺)0.5 g/L煙酰胺組(加入100 mol/L硝普鈉和0.5 g/L煙酰胺干預(yù))體外培養(yǎng)的兔腰椎間盤髓核細胞 文題釋義：髓核：是乳白色半透明膠狀體，富于彈性，為椎間盤結(jié)構(gòu)的一部分，位于兩軟骨板與纖維環(huán)之間。由縱橫交錯的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即軟骨細胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構(gòu)成的彈性膠凍物質(zhì)。嬰幼兒時期的髓核含水量為80%-90%，即使到了老年，其含水量也在70%上下。線粒體：是一種存在于大多數(shù)細胞中的由兩層膜包被的細胞器，是細胞中制造能量的結(jié)構(gòu)，是細胞進行有氧呼吸的主要場所，被稱為“power house”。

4、其直徑在0.5-1.0 m。摘要背景：一氧化氮可通過誘發(fā)炎性細胞因子的釋放，進而干擾細胞線粒體功能，加速椎間盤損傷及退變，是壓力等外界因子導(dǎo)致椎間盤退變的重要炎性細胞遞質(zhì)。目的：分析一氧化氮及一氧化氮合酶抑制劑煙酰胺對兔髓核細胞線粒體功能的影響及其與髓核細胞生物學(xué)行為的相關(guān)性。方法：將體外培養(yǎng)的兔腰椎間盤髓核細胞分為6組，正?？瞻讓φ战M、10 mol/L 硝普鈉組、100 mol/L硝普鈉組、200 mol/L硝普鈉組、0.05 g/L煙酰胺組(100 mol/L硝普鈉+0.05 g/L煙酰胺)、0.5 g/L煙酰胺組(加入100 mol/L硝普鈉和0.5 g/L煙酰胺干預(yù))，向各組培養(yǎng)基內(nèi)加

5、入不同劑量的一氧化氮供體硝普鈉及煙酰胺進行干預(yù)。干預(yù)3 d后檢測髓核細胞增殖活力、細胞內(nèi)ATP濃度、細胞內(nèi)活性氧水平、細胞內(nèi)一氧化氮合酶活性以及髓核細胞線粒體膜電位。結(jié)果與結(jié)論：兔髓核細胞經(jīng)不同濃度的硝普鈉干預(yù)3 d后，細胞內(nèi)一氧化氮合酶量隨硝普鈉濃度加大而增加、ATP濃度則隨著減小，與正常對照組比較差異有顯著性意義(P 0.01)；硝普鈉組可提高髓核細胞內(nèi)活性氧水平, 煙酰胺組呈劑量依賴性改善因硝普鈉干預(yù)下的細胞內(nèi)活性氧水平(P 0.01)；硝普鈉組可引起髓核細胞膜電位下降，煙酰胺組可減輕因硝普鈉引起的膜電位下降(P 0.01)；與硝普鈉組比較煙酰胺組也呈劑量依賴性促進髓核細胞增殖(P 0.

6、01)及改善髓核細胞的增殖活力，2組之間差異有顯著性意義(P 0.01)；結(jié)果說明，過量一氧化氮可損傷兔髓核細胞線粒體功能而導(dǎo)致細胞能量代謝障礙，煙酰胺能夠通過抑制一氧化氮的合成以及保護椎間盤細胞線粒體功能和改善細胞能量代謝，有助于預(yù)防椎間盤退變。關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；軟骨組織工程；髓核細胞；線粒體；一氧化氮；煙酰胺；一氧化氮合酶；能量代謝；國家自然科學(xué)基金主題詞：線粒體；一氧化氮；一氧化氮合酶；組織工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083基金資助：國家自然科學(xué)基金青年基金項目(30700841)；江西省贛州市科技計劃項目(3202745)Effect

7、s of nitric oxide and nitric oxide synthase inhibitors on mitochondrial function of nucleus pulposus cells Zhou Jian-guo1, Yang Cao2, Xiong Li-ming2 (1Department of Orthopedics, Peoples Hospital of Ganzhou, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China; 2Department of Orthopedics, Union Hospital Affiliate

8、d to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China)AbstractBACKGROUND: Nitric oxide can interfere with the function of mitochondria, and accelerate the intervertebral disc damage and degeneration by interfering with the release of inflamma

9、tory cytokines. Nitric oxide is an important inflammatory cell medium leading to degeneration of intervertebral disc induced by pressure and other external factors. OBJECTIVE: To investigate the regulatory effect of nitric oxide and nitric oxide synthase inhibitor niacinamide on mitochondrial functi

10、on and its association with biological behavior of rabbit nucleus pulposus. METHODS: Cultured nucleus pulposus cells of rabbit lumbar intervertebral disc were randomly divided into six groups: normal blank control group, 10 mol/L sodium nitroprusside group, 100 mol/L sodium nitroprusside group, 200

11、mol/L sodium nitroprusside group, 0.05 g/L nicotinamide group (100 mol/L sodium nitroprusside+0.05g/L nicotinamide), and 0.5 g/L nicotinamide group (100 mol/L sodium nitroprusside and 0.5 g/L nicotinamide). Different doses of nitric oxide donor sodium nitroprusside and nicotinamide were added in the

12、 medium of each group. Three days after intervention, cell proliferation activity, intracellular ATP concentration, cell nitric oxide synthase activity, cellular reactive oxygen species level, and mitochondrial membrane potential were detected respectively. RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 3 days o

13、f rabbit nucleus pulposus cells intervened by different concentrations of sodium nitroprusside, intracellular nitric oxide synthase content increased with sodium nitroprusside volume increase, and ATP concentration decreased along with sodium nitroprusside volume increase; there were significantly d

14、ifferences between the normal control group and sodium nitroprusside groups (P 0.01). (2) Reactive oxygen species could be increased in the sodium nitroprusside group. Niacinamide groups indicated a dose-dependent manner to improve the increase of cellular reactive oxygen species levels with sodium

15、nitroprusside intervention (P 0.01). (3) In the sodium nitroprusside groups, nucleus pulposus cell membrane potential decreased. In the niacinamide groups, sodium nitroprusside- induced decline in mitochondrial membrane potential was reduced (P 0.01). (4) Niacinamide groups also indicated a dose-dep

16、endent manner to improve the proliferative activity of nucleus pulposus cells as compared with sodium nitroprusside groups (P 0.01). Significant differences were determined between the two groups (P 0.01). (5) Results suggest that the excess nitric oxide can damage mitochondrial metabolic function o

17、f rabbit nucleus pulposus cells and cause cell energy metabolism. Niacinamide can reverse these damages by inhibiting nitric oxide synthesis, thereby contributing to the prevention against intervertebral disc degeneration. Subject headings: Mitochondria; Nitric Oxide; Nitric Oxide Synthase; Tissue E

18、ngineeringFunding: the Youth Fund Project of National Natural Science Foundation of China, No. 30700841; the Science and Technology Planning Project of Ganzhou City of Jiangxi Province, No. 3202745Zhou Jian-guo, Master, Department of Orthopedics, Peoples Hospital of Ganzhou, Ganzhou 341000, Jiangxi

19、Province, ChinaCorresponding author: Xiong Li-ming, M.D., Associate professor, Department of Orthopedics, Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, ChinaCite this article: Zhou JG, Yang C, Xiong LM. Effects of ni

20、tric oxide and nitric oxide synthase inhibitors on mitochondrial function of nucleus pulposus cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(42):6278-6283.6283ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction椎間盤退行性變是一系列脊柱退行性疾病如椎間盤突出、腰椎管狹窄等的前提和基礎(chǔ)病理過程。這一過程可表現(xiàn)為椎間盤內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，誘發(fā)炎性細胞遞質(zhì)的級聯(lián)釋放，導(dǎo)致椎間盤細

21、胞的細胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為改變，從而促進椎間盤損傷修復(fù)失衡。細胞的能量代謝障礙是椎間盤退變及損傷的重要機制，與細胞線粒體能量代謝密切相關(guān)1。一氧化氮可通過誘發(fā)炎性細胞因子的釋放，進而干擾細胞線粒體功能，加速椎間盤損傷及退變，是壓力等外界因子導(dǎo)致椎間盤退變的重要炎性細胞遞質(zhì)2。但椎間盤內(nèi)一氧化氮如何干擾椎間盤髓核細胞線粒體功能代謝、其損害與髓核細胞生物學(xué)行為變化有什么相關(guān)性均未見報道。實驗擬通過體外培養(yǎng)兔髓核細胞，以一氧化氮供體硝普鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)一氧化氮濃度，并加入一氧化氮合酶抑制劑煙酰胺進行干預(yù)調(diào)節(jié)，體外分析椎間盤髓核細胞的炎性細胞遞質(zhì)的變化及細胞線粒體功能代謝變化；同時椎間盤內(nèi)髓核細胞的

22、增殖、凋亡等生物學(xué)行為變更；并綜合評價一氧化氮及煙酰胺對髓核細胞線粒體能量代謝功能的影響及其相關(guān)機制。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 分組對照細胞學(xué)實驗。1.2 時間及地點 實驗于2011年12月至2013年10月在華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院和贛州市人民醫(yī)院完成。1.3 材料 2月齡左右日本大白兔10只，雌雄不限，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院實驗動物中心提供。1.4 實驗方法1.4.1 兔髓核細胞分離培養(yǎng)及分組 取2月齡左右日本大白兔10只。空氣栓塞致死后立即在無菌條件下完整取出整個腰段脊柱，仔細剝離纖維環(huán)后獲得髓核組織。DMEM/F12

23、細胞培養(yǎng)基反復(fù)漂洗后，剪成髓核組織呈漿糊狀。型膠原酶37 下充分消化25 min，200目網(wǎng)篩過濾，1 000 r/min離心5-7 min，去除上清液，再用培養(yǎng)基清洗2次后用含血清的培養(yǎng)基沖洗1次，將消化下來的髓核細胞培養(yǎng)于12孔培養(yǎng)板，并置于37 、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中作原代髓核細胞培養(yǎng)，每兩三天換液1次。體外培養(yǎng)兔髓核細胞分為6組，分別加入不同濃度的一氧化氮供體硝普鈉及煙酰胺進行干預(yù)：分組處理方法：組別處理正常空白對照組不加入藥物10 mol/L 硝普鈉組加入10 mol/L硝普鈉干預(yù)100 mol/L硝普鈉組加入100 mol/L硝普鈉干預(yù)200 mol/L硝普鈉組加入2

24、00 mol/L硝普鈉干預(yù)0.05 g/L煙酰胺組加入100 mol/L硝普鈉+0.05 g/L煙酰胺干預(yù)0.5 g/L煙酰胺組加入100 mol/L硝普鈉和0.5 g/L煙酰胺干預(yù)干預(yù)3 d后進行相關(guān)檢測。1.4.2 CCK-8檢測 按照CCK-8檢測試劑盒說明書操作：將3代培養(yǎng)的髓核細胞以1107 L-1細胞濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔加入200 L，每組設(shè)立5個復(fù)孔，置于37 、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培育3 d。干預(yù)3 d后，每組每孔加入20 L CCK-8溶液，充分震蕩搖勻，置于37 、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h后，450 nm測定細胞吸光度值(A)。1

25、.4.3 活性氧檢測 按照活性氧檢測試劑盒說明書操作，檢測髓核細胞內(nèi)活性氧水平。將培養(yǎng)的細胞以2107 L-1細胞濃度接種于12孔板內(nèi)，每孔1 mL。干預(yù)3 d后按照試劑盒說明書檢測細胞內(nèi)活性氧水平：細胞收集后重懸于稀釋好的檢測液中，使細胞濃度為(1.0-2.0)109 L-1，37 細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次后，立即以激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm，用熒光分光光度計檢測相對熒光強度。1.4.4 ATP濃度檢測 按照ATP檢測試劑說明書操作，檢測各組髓核細胞內(nèi)ATP濃度。干預(yù)3 d后，棄培養(yǎng)液后6孔板每孔加入200 L裂解液，充分裂解后4 12

26、 000g 離心10 min，收取上清；冰上溶解ATP檢測試劑，每個檢測管內(nèi)先加入100 L ATP檢測工作液，室溫放置 3-5 min，再加100 L 待測上清到檢測管內(nèi)，迅速混勻，立即用luminometer測定相對熒光強度，根據(jù)標準曲線計算出每組髓核細胞內(nèi)ATP濃度。1.4.5 一氧化氮合酶活性檢測 按照一氧化氮合酶檢測試劑盒說明書操作，檢測髓核細胞內(nèi)一氧化氮合酶濃度。將培養(yǎng)的細胞以1107 L-1細胞濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔加入200 L，每組設(shè)立5個復(fù)孔，置于37 、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培育3 d。干預(yù)3 d后，去除細胞培養(yǎng)液，加入100 L一氧化氮合酶檢測緩沖液，再

27、加入100 L檢測反應(yīng)液，輕輕搖勻。置于37 、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，取96孔板用熒光酶標記儀檢測相對熒光強度(激發(fā)波長為495 nm、發(fā)射波長為515 nm)，再計算出髓核細胞內(nèi)一氧化氮合酶活性。1.4.6 線粒體膜電位檢測 按照線粒體膜電位JC-1試劑盒說明書操作，檢測髓核細胞內(nèi)線粒體膜電位。將培養(yǎng)的髓核細胞以2107 L-1細胞濃度接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 mL。干預(yù)3 d后，先消化收集髓核細胞，再取適量細胞(約5105)重懸于0.5 mL細胞培養(yǎng)液中，并加入0.5 mL JC-1染色工作液，充分震蕩混勻，置于37 、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵

28、育20 min，4 600g離心4.0-5.0 min，去除上清液后，用配置好的預(yù)冷染色緩沖液充分漂洗2次，再取適量染色緩沖液重懸髓核細胞，取適量細胞懸液用熒光分光光度計分析細胞紅綠熒光比例；同時取出適量細胞懸液放在玻片上，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞綠色與紅色熒光。1.5 主要觀察指標 髓核細胞增殖活力；細胞內(nèi)ATP濃度；細胞內(nèi)活性氧水平；細胞內(nèi)一氧化氮合酶活性；髓核細胞線粒體膜電位。1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 分組計量資料統(tǒng)計結(jié)果均以s表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，P 0.05為差異有顯著性意義。 B AF E D C圖 2 兔髓核細胞線粒體m JC-1染色(200)Figure

29、2 m JC-1 staining of rabbit nucleus pulposus cell mitochondria (200)圖注：圖A為正?？瞻讓φ战M，產(chǎn)生紅色熒光為主，示細胞線粒體m穩(wěn)定；B為 10 mol/L硝普鈉組，產(chǎn)生紅色熒光減少，示細胞線粒體m降低；C為100 mol/L硝普鈉組，大部分為綠色熒光，紅色熒光較少；D為200 mol/L硝普鈉組，產(chǎn)生綠色熒光為主，示細胞線粒體m穩(wěn)定性極差；E為0.05 g/L煙酰胺組，紅色熒光逐漸增多，示細胞線粒體m升高；F為0.5 g/L煙酰胺組，產(chǎn)生紅色熒光明顯增多，示細胞線粒體m較穩(wěn)定。1.00.20表1 不同劑量的

30、煙酰胺及硝普鈉對髓核細胞作用3d后細胞內(nèi)活性氧水平、ATP濃度及細胞內(nèi)一氧化氮合酶量 (s)Table 1 Effects of different doses of nicotinamide and sodium nitroprusside on intracellular reactive oxygen species level, ATP concentration and intracellular nitric oxide synthase levels for 3 days of intervention on nucleus pulposus cellsA450值A(chǔ) B C D

31、E F 表注：與空白對照組比較，aP 0.01；與200 mol/L硝普鈉組比較，bP 0.01；與硝普鈉組比較，cP 0.01；與0.05 g/L煙酰胺組比較，dP 0.05。組別一氧化氮合酶(U/mL)活性氧 (Flu)ATP (mol/L)空白對照組16.822.10727.831.154.55 0.1110 mol/L 硝普鈉組21.722.60a743.171.39a3.850.12a100 mol/L硝普鈉組28.322.10a765.451.76ab3.570.13a200 mol/L硝普鈉組29.302.40a794.361.50a 3.510.12a0.05 g/L煙酰胺組1

32、9.211.80ac600.831.59ac3.670.13ac0.5 g/L煙酰胺組13.122.20acd88.301.49acd3.840.10acd圖1 兔髓核細胞細胞增殖活力CCK-8試劑盒檢測結(jié)果Figure 1 CCK-8 kit test results of proliferation viability of rabbit nucleus pulposus cells圖注：圖中A為空白對照組；B為10 mol/L 硝普鈉組；C為 100 mol/L硝普鈉組；D為200 mol/L硝普鈉組；E為0.05 g/L煙酰胺組；F為0.5 g/L煙酰胺組。結(jié)果表明一氧化氮供體硝普鈉對

33、兔椎間盤髓核細胞增殖具有明顯抑制作用，一氧化氮合酶抑制劑煙酰胺干擾可明顯改善兔椎間盤髓核細胞的增殖活力。表2 不同劑量的煙酰胺及硝普鈉對髓核細胞作用3d后髓核細胞紅綠熒光比值 (s)Table 2 Red and green fluorescence ratio of nucleus pulposus cells for 3 days of intervention with different doses of nicotinamide and sodium nitroprusside組別紅綠熒光比值空白對照組1.640.5810 mol/L 硝普鈉組1.430.71a100 mol/L硝普

34、鈉組1.120.76ab200 mol/L硝普鈉組0.970.71a0.05 g/L煙酰胺組1.360.77ac0.5 g/L煙酰胺組1.660.8acd表注：與空白對照組比較，aP 0.01；與200 mol/L硝普鈉組比較，bP 0.01；與硝普鈉組比較，cP 0.01；與0.05 g/L煙酰胺組比較，dP 0.05。2 結(jié)果 Results2.1 CCK-8檢測 各組髓核細胞增殖活力見圖1。與空白對照組比較，一氧化氮供體硝普鈉干預(yù)組呈濃度依賴性抑制髓核細胞增殖(均P 0.01)，其中200 mol/L硝普鈉組抑制最強。與硝普鈉干預(yù)組比較，一氧化氮合酶抑制劑煙酰胺組也呈濃度依賴性增強髓核細

35、胞的增殖能力(均P 0.01)，煙酰胺2組間差異有顯著性意義(P 0.01)。結(jié)果表明一氧化氮對兔椎間盤髓核細胞增殖具有明顯抑制作用，干擾一氧化氮的合成可明顯改善兔椎間盤髓核細胞的增殖活力。2.2 活性氧檢測 用熒光分光光度計分析各組髓核細胞內(nèi)活性氧水平，與對照組比較，硝普鈉干預(yù)組呈濃度依賴性提高髓核細胞內(nèi)活性氧水平(均P 0.01)，以200 mol/L硝普鈉組刺激最強。而與硝普鈉干預(yù)組比較，煙酰胺組也呈濃度依賴性降低髓核細胞內(nèi)活性氧水平(均P 0.01)，煙酰胺2組間差異有顯著性意義(P 0.01)，見表1。 2.3 一氧化氮合酶及ATP含量檢測 分別用熒光酶標記儀、luminometer

36、測定檢測一氧化氮合酶及ATP相對熒光強度：加入硝普鈉后10 mol/L 硝普鈉組、100 mol/L硝普鈉組、200 mol/L硝普鈉組一氧化氮合酶活性與正常對照組比較均有所增強，其中200 mol/L硝普鈉組刺激作用最強(P 0.01)，而ATP濃度均較正常對照組有所下降(P 0.01，P 0.01，P 0.05)，存在最大刺激劑量效應(yīng)。與200 mol/L硝普鈉組比較，煙酰胺組一氧化氮合酶的活性顯著下降(P 0.05)，ATP濃度顯著增加(P 0.05，見表1。結(jié)果表明煙酰胺可抑制一氧化氮合酶的生物活性、減少一氧化氮的合成、改善細胞內(nèi)ATP濃度，從而改善髓核細胞的能量代謝、抑制髓核細胞的過

37、量的凋亡。2.4 線粒體膜電位檢測 采用倒置熒光顯微鏡下觀察細胞綠色與紅色熒光：細胞內(nèi)線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中螯合成聚合物，從而產(chǎn)生紅色熒光；而電位低時，JC-1不能聚集螯合形成聚合物，則產(chǎn)生綠色熒光。倒置熒光顯微鏡下觀察顯示，空白對照組以紅色熒光為主，提示該組線粒體膜電位(m)穩(wěn)定，髓核細胞功能正常(圖2A)；硝普鈉組則以產(chǎn)生綠色熒光為主，提示髓核細胞內(nèi)線粒體m明顯下降(圖2B，C，D)；而加了硝普鈉和煙酰胺0.05 g/L煙酰胺組、0.5g/L煙酰胺組與單純硝普鈉組比較，則紅色熒光依煙酰胺濃度增加而增強(圖2E、F)，二者間差異有顯著性意義(P 0.05)。采用熒光分

38、光光度計分析各組髓核細胞紅綠熒光比值：硝普鈉干預(yù)組紅綠熒光比值較正常對照組均明顯下降(均P 0.01)，其下降程度與硝普鈉濃度相關(guān)，以200 mol/L硝普鈉組下降最明顯，組間有顯著性差異 (P 0.05)；而煙酰胺組較硝普鈉組均有明顯上升(均P 0.01)，2組之間差異有顯著性意義(P 0.05)(表2)。結(jié)果表明一氧化氮可通過激發(fā)椎間盤髓核細胞內(nèi)一氧化氮合酶、活性氧的活性，從而損害兔椎間盤髓核細胞增殖活性、誘發(fā)髓核細胞凋亡，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抑制劑通過干擾一氧化氮的合成，從而改善椎間盤髓核細胞線粒體功能，促進椎間盤髓核細胞的增殖活性。3 討論 Discussion椎間盤退變是多種環(huán)境因素共

39、同作用的結(jié)果，其機制研究一直為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。椎間盤細胞能量代謝障礙是腰椎間盤退行性改變的一個重要機制。一方面是壓力、外傷等外界因素加速椎間盤軟骨終板的退變，而軟骨終板的退變導(dǎo)致椎間盤內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)彌散障礙，進而促進炎癥細胞因子的釋放，進一步可導(dǎo)致細胞內(nèi)線粒體變形、線粒體內(nèi)滲透壓改變等，從而干擾細胞能量代謝1；一方面是能量代謝障礙誘發(fā)細胞凋亡加速，促進椎間盤內(nèi)細胞基質(zhì)代謝失衡，導(dǎo)致椎間盤進入難以自行修復(fù)的退變3-5。一氧化氮作為一活潑的生物小分子，是由一氧化氮合成酶于L-精氨酸產(chǎn)生的，它具有很強的細胞毒性功能，可通過多種途徑產(chǎn)生組織細胞損傷作用。有報道顯示在腰椎間盤突出癥患者的椎間盤組織表達

40、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA，誘發(fā)一氧化氮過量釋放，促進炎性細胞遞質(zhì)的大量釋放，進而增強膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶活性，促進型膠原及細胞基質(zhì)的裂解，導(dǎo)致椎間盤內(nèi)細胞及基質(zhì)紊亂，從而造成椎間盤退變6-8。另一方面，一氧化氮可進一步激活多聚 ADP-核糖聚合酶 (Poly ADP-ribose polymerase，PARP)，從而大量消耗NAD，導(dǎo)致細胞內(nèi)糖酵解速度的降低、線粒體呼吸鏈的電子傳遞減緩；此外，一氧化氮還可導(dǎo)致細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧，使得細胞內(nèi)線粒體的膜脂質(zhì)過度氧化，不但直接損傷細胞，而且直接抑制細胞內(nèi)線粒體的呼吸，引起細胞內(nèi)ATP減少，從而導(dǎo)致細胞凋亡9-10。煙酰胺是煙酰胺腺嘌呤二核苷

41、酸即輔酶(NAD)的前體，在生物氧化過程中起遞氫作用，其具有抗自由基抗氧化作用從而減少線粒體損傷，保護線粒體呼吸功能，改善線粒體能量代謝從而促進細胞能量代謝的作用11-12。以往研究報道了煙酰胺在體外表現(xiàn)可促進轉(zhuǎn)化生長因子1的合成及抑制白細胞介素1誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達而降低一氧化氮合成與釋放，改善椎間盤細胞能量代謝，促進細胞增殖和減少細胞凋亡的作用，進而促進椎間盤組織內(nèi)aggrecan和膠原的合成及分泌，從而能抵抗白細胞介素1導(dǎo)致的基質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，改善椎間盤退變13。實驗通過向體外兔椎間盤髓核細胞培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的硝普鈉，誘發(fā)髓核細胞凋亡，激發(fā)一氧化氮合酶的活性，促進的一氧化氮分泌

42、，后加入不同劑量的特異性誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抑制劑煙酰胺，抑制一氧化氮合成而改善細胞線粒體功能。綜合實驗結(jié)果顯示：與正常對照組比較，硝普鈉干預(yù)組不但可濃度依賴性增加髓核細胞內(nèi)一氧化氮合酶活性，并提高髓核細胞內(nèi)活性氧水平，還可濃度依賴性減少髓核細胞內(nèi)ATP濃度、降低髓核細胞線粒體膜電位及抑制髓核細胞增殖，分析其機制可能與一氧化氮氧化損傷髓核細胞線粒體功能引起能量代謝障礙以及激活凋亡相關(guān)蛋白引起線粒體釋放細胞色素C途徑激發(fā)細胞凋亡14-16。而煙酰胺干預(yù)組以濃度劑量依賴性降低髓核細胞內(nèi)一氧化氮合酶活性及活性氧水平、提升髓核細胞線粒體膜電位水平、增加髓核細胞內(nèi)ATP量、改善髓核細胞的增殖能力，這可能主

43、要與煙酰胺抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達而降低一氧化氮合成，減少線粒體損傷及保護線粒體功能改善細胞能量代謝。此外煙酰胺具有較強抗炎抗自由基作用17-18。綜上所述，一氧化氮可明顯提高髓核細胞內(nèi)活性氧水平，使得細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，從而改變髓核細胞膜通透性，損害髓核細胞的線粒體能量代謝功能，誘發(fā)炎性細胞因子的合成及釋放，進一步降低髓核細胞增殖活力，激發(fā)髓核細胞凋亡；而煙酰胺能夠通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達，降低一氧化氮合成與釋放，減少炎性細胞遞質(zhì)的分泌，改善髓核細胞的內(nèi)環(huán)境，減輕一氧化氮對髓核細胞線粒體功能的損害，進一步保護髓核細胞能量代謝而改善椎間盤退變。因此，改善椎間盤細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，可改善

44、髓核細胞的線粒體功能，進而保護細胞能量代謝有助于預(yù)防椎間盤退變；通過抑制一氧化氮的合成，減少炎性細胞遞質(zhì)的級聯(lián)反應(yīng)，進一步保護退變椎間盤內(nèi)細胞線粒體的能量代謝功能，則有可能抑制椎間盤細胞凋亡，從而改善甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。這也提示可以用特異性抑制一氧化氮合酶或一氧化氮的藥物如煙酰胺來阻止或延緩椎間盤退變，為臨床上預(yù)防和治療椎間盤退變開辟一條新的途徑。作者貢獻：設(shè)計、評估為第一作者和通訊作者，實施為全體作者，否盲法評估。利益沖突：所有作者共同認可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問題：實驗動物在戊巴妥納麻醉下進行所有的手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CN

45、KI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻 References1 聶克,楊述華,熊蠡茗,等.AMPK與P16ink4在退變腰椎間盤髓核組織中的表達及其意義J.中國中醫(yī)骨傷科雜志, 2009,17(1):8-10.2 柳根哲,徐林,李春根,等.靜水壓對人體腰椎間盤一氧化氮產(chǎn)生及蛋白多糖合成的影響J.中國臨床

46、康復(fù),2005,9(2): 100-102. 3 Le Maitre CL, Pockert A, Buttle DJ, et al. Matrix synthesis and degradation in human intervertebral disc degeneration. Biochem Soc Trans.2007; 35( 4):652-655.4 徐蔚蔚,邵增務(wù),郭兵,等.煙酰胺對椎間盤、型膠原的保護作用J.中國中醫(yī)骨傷科雜志, 2008, 16(6): 21-25.5 Benneker LM, Heini PF, Alini M, et al. 2004 Young In

47、vestigator Award Winner:vertebral endplate marrow contact channel occlusions and intervertebral disc degeneration.Spine.2005;30(2):167-73.6 Xu RB, Shao ZW, Xiong LM, et al. Experimental Study on Inhibitory Effect of Niacinamide on Tumor Necrosis Factor-alpha-induced Matrix Degradation of Annulus Fib

48、rous Tissue in vitro. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci.2008; 28 (5):576-579.7 Rannou F, Richette P, Benallaoua M, et al. Cyclic tensile stretch modulates proteoglycan production by intervertebral disc annulus fibrosus cells through production of nitrite oxide. J Cell Biochem.2003;90(1): 148-157.8 Liu GZ,Ishihara H,Osada R,et al.Nitric oxide mediates the change of proteoglycan synthesis in the human lumbar intervertebral disc in